На главную
На главную

Применение показателей и критериев нарушения биотрансформации бензола в организме детей для задач гигиенических оценок. санитарно-эпидемиологических расследований и экспертиз

Методические рекомендации разработаны для повышения эффективности гигиенических оценок, санитарно-эпидемиологических расследований и экспертиз по выявлению нарушений состояния здоровья в связи с воздействием химических факторов. В методических рекомендациях определены показатели и критерии нарушения биотрансформации бензола в организме детей при хроническом внешнесредовом аэротехногенном воздействии.

Обозначение: МР 2.1.10.0077-13
Название рус.: Применение показателей и критериев нарушения биотрансформации бензола в организме детей для задач гигиенических оценок. санитарно-эпидемиологических расследований и экспертиз
Статус: действует
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.10.2014
Дата введения в действие: 20.08.2013
Утвержден: 20.08.2013 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Опубликован: Роспотребнадзор (2013 г. )
Ссылки для скачивания:

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

2.1.10. ГИГИЕНА. КОММУНАЛЬНАЯ ГИГИЕНА.
СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ В СВЯЗИ
С СОСТОЯНИЕМ ОКРУЖАЮЩЕЙ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ И
УСЛОВИЯМИ ПРОЖИВАНИЯ НАСЕЛЕНИЯ

Применение показателей и критериев
нарушения биотрансформации бензола
в организме детей для задач
гигиенических оценок,
санитарно-эпидемиологических
расследований и экспертиз

Методические рекомендации
MP 2.1.10.0077-13

Москва 2013

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Н.В. Зайцева, М.А. Землянова, Ю.В. Кольдибекова, Т.С. Уланова, О.В. Долгих, Д.А. Кирьянов, В.М. Чигвинцев, В.Н. Звездин).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 августа 2013 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Общие положения. 2

2. Область применения. 2

3. Основная часть. 3

3.1. Термины и определения. 3

3.2. Перечень сокращений. 3

3.3. Введение. 3

3.4. Специальная часть. 5

Нормативные правовые и методические документы.. 6

Библиографические данные. 6

Приложение 1 (справочное) Перечень средств измерений, вспомогательных устройств и реактивов, необходимых для количественного определения бензола и фенола в биосредах (кровь, моча) газохроматографическим методом.. 7

Приложение 2 (справочное) Требования и перечень оборудования, необходимого для реализации исследования и оценки состояния цитохрома Р-450 и глутатионовой системы.. 8

Приложение 3 (справочное) Требования и перечень используемых реактивов и тест-систем, необходимых для исследования и оценки состояния цитохрома Р-450 и глутатионовой системы.. 9

Приложение 4 (справочное) Пример апробации методики исследования показателей нарушения биотрансформации бензола в организме детей, проживающих в условиях хронического внешнесредового воздействия бензола. 9

 

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

20 августа 2013 г.

Дата введения: с момента утверждения

2.1.10. ГИГИЕНА. КОММУНАЛЬНАЯ ГИГИЕНА.
СОСТОЯНИЕ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ В СВЯЗИ
С СОСТОЯНИЕМ ОКРУЖАЮЩЕЙ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ И
УСЛОВИЯМИ ПРОЖИВАНИЯ НАСЕЛЕНИЯ

Применение показателей и критериев нарушения
биотрансформации бензола в организме детей
для задач гигиенических оценок, санитарно-
эпидемиологических расследований и экспертиз

Методические рекомендации
MP 2.1.10.0077-13

1. Общие положения

1.1. Настоящие методические рекомендации разработаны для повышения эффективности гигиенических оценок, санитарно-эпидемиологических расследований и экспертиз по выявлению нарушений состояния здоровья в связи с воздействием химических факторов. В настоящих методических рекомендациях определены показатели и критерии нарушения биотрансформации бензола в организме детей при хроническом внешнесредовом аэротехногенном воздействии.

1.2. Проведение исследований осуществляется по запросу органов и организаций Роспотребнадзора научно-исследовательскими организациями, а также иными научно-исследовательскими или лечебно-профилактическими учреждениями, привлекаемыми в соответствии с п. 6.4 постановления Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 № 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», аккредитованными в установленном порядке для проведения работ по оценке риска для здоровья населения, исследований биологических объектов, материалов и сред, а также имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности.

1.3. Все исследования осуществляются в строгом соответствии с требованиями действующих нормативных правовых и методических документов.

1.4. Планирование и проведение исследований осуществляется с обязательным соблюдением принципов надлежащей лабораторной практики Principles of Good Laboratory Practice (ENV/MC/CHEM (98)17) в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53434-09 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

1.5. В настоящих рекомендациях использованы результаты исследования и оценки нарушений биотрансформации бензола и его метаболита - фенола в организме детей, связанных с хроническим внешнесредовым аэротехногенным воздействием бензола и отсутствием, аэрогенного поступления фенола, и сравнительно с результатами исследований у детей, проживающих в условиях отсутствия аэрогенного воздействия данных химических соединений.

2. Область применения

2.1. Методические рекомендации предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека при проведении санитарно-гигиенических экспертиз, расследований, исследований в области гигиенической оценки по установлению причинно-следственных связей между факторами среды обитания и здоровьем населения субъектов Российской Федерации.

Рекомендации также могут быть использованы научно-исследовательскими, лечебно-профилактическими и другими организациями, занимающимися вопросами гигиенической оценки, предотвращения и снижения неблагоприятных последствий воздействия факторов среды обитания на здоровье человека.

3. Основная часть

3.1. Термины и определения

Биотрансформация - энзиматическое превращение жирорастворимых экзогенных или эндогенных соединений в полярные водорастворимые метаболиты, легко выводимые из организма.

Конъюгация - реакция синтеза чужеродного вещества с эндогенными молекулами или их группировками (аминокислоты, глюкуроновая или серная кислоты и др.), в результате чего образуются конъюгаты - более полярные, гидрофильные соединения, легко выводимые го организма.

Элиминация - удаление чужеродного вещества го организма, состоящее из двух процессов: нейтрализации путем биотрансформации и собственно экскреции.

Глутатионовая система - многокомпонентная система, включающая в себя комплекс ферментов (глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатион-6-трансфераза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), осуществляющих конъюгационно-элиминационную функцию соединений во II фазе биотрансформации веществ.

Глутатионпероксидаза - фермент, защищающий от окислительного повреждения восстановительный глутатион, участие которого необходимо в эндогенном связывании чужеродного вещества.

Глутатионредуктаза - фермент, катализирующий реакцию восстановления глутатиона из его окисленной формы.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - фермент, обеспечивающий образование клеточного НАДФ-Н, необходимого для поддержания восстановленного глутатиона.

Глутатион-S-трансфераза - фермент, катализирующий присоединение глутатиона к эндогенному или чужеродному соединению.

3.2. Перечень сокращений

Гл-6-Ф - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГлSТр - гутатион-S-трансфераза

ГлПО – глутатионпероксидаза

ГлР – глутатионредуктаза

ИФА - иммуноферментный анализ

НАДФ-Н - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный

Rfcchi - референтная концентрация для хронического ингаляционного воздействия

3.3. Введение

На промышленно развитых территориях с размещением предприятий органического синтеза, химической, нефтеперерабатывающей, нефтехимической отраслей и развитой транспортной инфраструктурой к одним из приоритетных и распространенных загрязнителей атмосферного воздуха относится бензол, являющийся истинным ксенобиотиком и высоко опасным химическим веществом для здоровья человека [1].

При ингаляционном поступлении в организм большая часть бензола (до 84 %) подвергается биотрансформации, которая осуществляется в основном в печени [2]. В процессе биотрансформации происходит окисление бензола через промежуточный метаболит - фенол, с образованием конечного продукта - фенилсульфата [3, 4]. Схематическое изображение биотрансформации бензола представлено на рис. 1 [4].

Рис. 1. Биотрансформация бензола

Биотрансформацию бензола и его метаболита фенола в организме осуществляет система цитохромов Р-450 и глутатионовая система [5]. В первой фазе биотрансформации система цитохромов Р-450 обеспечивает переход бензола в полярное и гидрофильное относительно исходного соединение - фенол, что обусловливает возможность его быстрой экскреции из организма. Во вторую фазу биотрансформации глутатионовая система обеспечивает конъюгацию фенола с эндогенным глутатионом, в результате чего образуется конечный метаболит - фенилсульфат, который в дальнейшем легко подвергается элиминации из организма. При этом фенол, по сравнению с фенилсульфатом, представляет большую опасность для здоровья человека [6].

Хроническое внешнесредовое аэротехногенное воздействие бензола может обусловливать наличие бензола и увеличение концентрации его метаболита - фенола в биосредах (кровь, моча) в результате нарушения процесса биотрансформации. Это может являться следствием дисфункции систем, обеспечивающих процесс биотрансформации бензола. Наличие бензола и повышенное содержание фенола в биосредах может обусловить развитие заболеваний крови и кроветворных органов, центральной нервной, иммунной, сердечно-сосудистой систем, печени, почек [3].

Выявление и оценка нарушений биотрансформации бензола в организме при хроническом ингаляционном поступлении в организм включает поэтапное выполнение следующих процедур:

1) исследование и оценку содержания бензола и фенола в крови и моче. Количественное определение бензола в крови и моче осуществляется газохроматографическим методом в соответствии с методическими рекомендациями, действующими в Российской Федерации (МУК 4.1.764-99 и 4.1.765-99). Определение массовой концентрации фенола в крови и моче осуществляется газохроматографическим методом в соответствии с методическими рекомендациями, действующими в Российской Федерации (МУК 4.1.2107-06 и 4.1.2108-06);

2) исследование и оценку состояния функций систем, обеспечивающих первую и вторую фазы биотрансформации бензола, по комплексу показателей:

а) состояние системы цитохрома Р-450 (гена CYP1A1), участвующего в первой фазе биотрансформации.

Методика основана на принципе полимеразной цепной реакции, в основе которой лежит амплификация и детекция продуктов этой реакции в режиме реального времени с помощью флюоресцентных меток, которыми предварительно помечают используемые для реакции амплификации праймеры в соответствии с инструкцией к тест-системе;

б) активность ферментов глутатионовой системы, участвующей во второй фазе биотрансформации:

- активность глутатионпероксидазы - фермента, защищающего от окислительного повреждения восстановленный глутатион, необходимый в эндогенном связывании фенола. Активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови определяется фотометрическим методом, основанным на принципе «сэндвич» иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к тест-системе ИФА;

- активность глутатионредуктазы - фермента, катализирующего реакцию восстановления глутатиона из его окисленной формы. Активность глутатионредуктазы определяется кинетическим методом по принципу каталитического восстановления глутатиона в присутствии восстановленного НАДФ-Н по степени уменьшения абсорбции этого процесса в соответствии с инструкцией к тест-системе биохимического анализа;

- активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - фермента, обеспечивающего образование клеточного НАДФ-Н, необходимого для поддержания восстановленного глутатиона для эндогенного связывания фенола. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяется кинетическим методом по степени увеличения абсорбции в результате превращения НАДФ+ в соответствии с инструкцией к тест-системе биохимического анализа;

- активность глутатион-S-трансферазы - фермента, катализирующего присоединение глутатиона к эндогенно образованному фенолу. Активность глутатион-S-трансферазы в сыворотке крови определяется фотометрическим методом, основанным на принципе твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к тест-системе ИФА.

Требования и перечень необходимого оборудования, расходных материалов, реактивов и тест-систем для выполнения исследований представлены в прилож. 2, 3.

3.4. Специальная часть

3.4.1. Нарушение биотрансформации бензола возникает:

· при наличии патологического аллеля цитохрома Р-450, что свидетельствует о наследственной предрасположенности к нарушению процесса биотрансформации;

· при дисфункции ферментов глутатионовой системы, обеспечивающих связывание и выведение бензола и его метаболита - фенола из организма, обусловленной ингаляционным поступлением бензола в концентрациях, превышающих референтные уровни хронического ингаляционного воздействия (Rfcchr) (Р 2.1.10.1920-04).

3.4.2. Показателями нарушения биотрансформации бензола в организме является наличие бензола и повышенных концентраций фенола (как метаболита бензола) в крови и моче.

3.4.3. Гигиеническими критериями для проведения химико-аналитического исследования биосред у детей на содержание бензола и фенола являются:

· наличие бензола в атмосферном воздухе селитебной застройки выше предельно допустимой концентрации (более 1 ПДКсс - 0,1 мг/м3) и референтной концентрации при ингаляционном поступлении (более 1 Rfcchr - 0,03 мг/м3);

· отсутствие фенола в атмосферном воздухе селитебной зоны для исключения его экзогенного поступления в организм.

3.4.4. Критериями нарушения биотрансформации бензола являются следующие показатели:

· идентификация бензола в крови и моче выше предела обнаружения (0,0035 мг/дм3);

· наличие фенола в крови и моче выше фоновых уровней (в крови - (0,010 ± 0,005) мг/дм3, моче - (0,278 ± 0,021) мг/дм3) в 1,2 раза;

· распространенность минорного аллеля по гену цитохрома Р-450 CYP1A1 выше 10 %;

· повышение активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови в 1,2 - 1,4 раза относительно контроля и границы чувствительности метода (> 54,7 нг/см3);

· повышение активности глутатионредуктазы в сыворотке крови в 1,6 - 1,8 раза относительно контроля и границы чувствительности метода (> 80 Е/дм3);

· повышение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови в 1,2 - 1,3 раза относительно контроля и границы чувствительности метода (> 4,1 Е/дм3);

· понижение активности глутатион-8-трансферазы в сыворотке крови в 2,5 - 2,6 раза относительно контроля и границы чувствительности метода. (< 110 нг/см3).

3.4.5. При наличии нарушения связывания и выведения бензола и фенола из организма необходимо контролировать развитие нарушений у детей со стороны:

· крови и кроветворных органов (нарушение процессов костно-мозгового кроветворения - анемия неуточненная - D64.9, апластическая анемия, вызванная внешними агентами - D61.2);

· центральной нервной системы и сердечно-сосудистой системы (функциональные расстройства нервной системы - астеноневротический синдром - R45.0, астеновегетативные нарушения и другие расстройства вегетативной нервной системы - G90.8);

· иммунной системы (супрессия процессов иммунной защиты и неспецифической резистентности - вторичное иммунодефицитное состояние - D83.9).

Реализация предложенной методики исследования представлена в прилож. 4.

Нормативные правовые и методические документы

· Федеральный закон от 30.03.1999 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

· Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 № 322 (с изменениями) «Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».

· Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 19.07.2007 № 224 «О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах оценок».

· ГОСТ 8.207-76 «Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения».

· МУК 4.1.765-99 «Газохроматографический метод количественного определения ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (кровь)».

· МУК 4.1.764-99 «Газохроматографический метод количественного определения предельных (гексан, гептан) и ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (моча)».

· МУК 4.1.2108-06 «Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом».

· МУК 4.1.2107-06 «Определение массовой концентрации фенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом».

· Р 2.1.10.1920-04 «Руководство по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ».

Библиографические данные

1. Кольдибекова Ю.В. Оценка конъюгационно-элиминационной функции глутатионовой системы у детей при хроническом экзогенном поступлении бензола //Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. В 2 т. /Под общ. ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад. РАМН Н.В. Зайцевой. Пермь: Книжный формат, 2012. Т.1. С. 301 - 304.

2. Вредные вещества в промышленности: Справочник в 3 томах. Том I. Органические вещества /Под ред. Н.В. Лазарева, Э.Н. Левиной. Л.: Химия, 1976. 592 с.

3. Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология: Учебник /Под ред. Р.У. Хабриева, Н.И. Калетиной. М.: ГОЭТАР - Медиа, 2010. 752 с.

4. Онищенко Г.Г. Гигиеническая индикация последствий для здоровья при внешнесредовой экспозиции химических факторов /Г.Г. Онищенко, Н.В. Зайцева, М.А. Землянова; под ред. Г.Г. Онищенко. Пермь: Книжный формат, 2011. С. 126 - 130.

5. Землянова М.А., Кольдибекова Ю.В. Современные подходы к оценке нарушений метаболизма ксенобиотиков при поступлении в организм из внешней среды //Экология человека. 2012. № 8. С. 8 - 14.

6. Зайцева Н.В. Гигиеническая диагностика нарушений метаболизма ароматических углеводородов для эпидемиологических исследований влияния внешнесредовых факторов /Н.В. Зайцева, М.А. Землянова, В.Н. Звездин, Е.Р. Комлева, Д.А. Кирьянов, Т.С. Уланова, В.М. Чигвинцев. М.: ВНТИЦ, № гос. рег. 02201150764.

Приложение 1
(справочное)

Перечень средств измерений, вспомогательных устройств и реактивов, необходимых для количественного определения бензола и фенола в биосредах (кровь, моча) газохроматографическим методом

При выполнении исследований применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

1. Перечень средств измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором

Весы лабораторные аналитические

ГОСТ 24104-80Е

Секундомер

2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм

Бидистиллятор

ГОСТ 15150-69

Редуктор кислородный

ТУ 26-05-235-70

Микрошприцы

ТУ 5Е2.833.106

Шприцы медицинские стеклянные вместимостью 5 см3

ТУ 64-1-378-83

Колбы мерные вместимостью 1000 см3

ГОСТ 1770-74Е

Пипетки вместимостью 1, 5, 10 см3

ГОСТ 20292-74

Пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 см3

ГОСТ 1770-74Е

3. Вспомогательные материалы и реактивы

Гелий в баллоне

ТУ 51-940-80

Водород технический

ГОСТ 3022-80

Воздух в баллоне

ГОСТ 11882-73

Apiezon L на хроматоне N-cyпер фракции 0,16 - 0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки

Бензол, х.ч.

ТУ 6-09-787-76

Толуол, х.ч.

ТУ 6-09-787-76

Фенол, х.ч.

ТУ 6-09-787-76

Этилбензол, х.ч.

ТУ 6-09-787-76

П-, м-ксилол, х.ч.

ТУ 6-09-915-76

О-ксилол

ГСО 2913-84

Щавелевая кислота, ч

ГОСТ 22180-76

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

Приложение 2
(справочное)

Требования и перечень оборудования, необходимого для реализации исследования и оценки состояния цитохрома Р-450 и глутатионовой системы

1. Оборудование должно иметь государственный сертификат соответствия техническому регламенту, свидетельство о прохождении метрологического контроля аккредитованными для этого организациями в установленном порядке и в установленные сроки.

2. Для каждого прибора, используемого в исследованиях, в журнале фиксируются следующие сведения: наименование прибора, наименование производителя, страна-изготовитель, модель прибора, серийный (заводской) номер, дата приобретения и постановки на учет в лаборатории, дата запуска в эксплуатацию, инвентарный номер, дата и номер свидетельства метрологического контроля на момент исследования, место расположения прибора.

3. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и руководством пользователя. Выполнение исследований проводят при нормальных климатических условиях в соответствии с ГОСТ 15150: температура воздуха (20 ± 1) °С; атмосферное давление 630 - 800 мм рт.ст.; влажность воздуха не более 80 % при температуре 25 °С. Результаты проведения калибровки, поверки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, датируются и заверяются подписью сотрудника, эксплуатирующего оборудование. Журнал должен быть доступен для сотрудников, обеспечивающих его обслуживание.

4. Средства измерения

Весы лабораторные 2-го класса точности (максимальная нагрузка до 200 г, основная погрешность при измерении не более 0,2 мг) для взвешивания сухих ингредиентов при подготовке рабочих растворов

Ионометр (рН-метр) для определения рН буферных растворов

5. Оборудование

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм

Анализатор иммуноферментный микропланшетный автоматический

Амплификатор

Центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора до 3000 об./мин для пробирок вместимостью 15 см3

Центрифуга

Термостат твердотельный

Шейкер планшетный термостатируемый

Прибор для промывки планшет

Холодильник лабораторный с морозильной камерой 2 - 14/-20 -30 °С или аналогичный

ГОСТ 26678-85

Облучатель-рециркулятор медицинский бактерицидный

Дистиллятор

6. Вспомогательные материалы и лабораторная посуда

Бидистиллятор

ГОСТ 15150-69

Редуктор кислородный

ТУ 26-05-235-70

Регулируемые автоматические дозаторы 1-канальные (10 - 100, 100 - 1000, 500 - 5000 мкл), погрешность ±1 мкл

Регулируемые автоматические дозаторы 8-канальные (5 - 50, 50 - 300 мкл) погрешность ±1 мкл

Стаканы стеклянные химические объемом 50, 500 см3

ГОСТ 10394-72

Лабораторные штативы

ТУ 64-1-2669-73

Наконечники пластиковые для автоматических дозаторов объемом 10 - 300 мкл, 200 - 1000 мкл, 1000 - 5000 мкл

Перчатки резиновые

ГОСТ 3-88

Пробирки вакуумные пластиковые Improve без коагулянта объемом 9 см3

Зонд урогенитальный, одноразовый, стерильный

Транспортная среда для хранения и транспортирования респираторных мазков

Пробирки

ГОСТ 10515-75

Приложение 3
(справочное)

Требования и перечень используемых реактивов и тест-систем, необходимых для исследования и оценки состояния цитохрома Р-450 и глутатионовой системы

1. Реактивы и тест-системы, используемые в исследованиях, должны иметь государственный сертификат соответствия. Характеристики реактивов и тест-систем должны быть паспортизированы и иметь документированный сертификат гарантированного срока использования. Условия проведения исследований на тест-системах должны выполняться строго по инструкции производителя или специально разработанным стандартным операционным процедурам и исключать воздействие внешних факторов, способных повлиять на качество выполнения исследований.

2. Реактивы и тест системы

Вода бидистиллированная

Магния хлорид, х.ч.

ГОСТ 4165-78

Натрия хлорид, х.ч.

ГОСТ 4233-77

Натрия додецилсульфат

Спирт этиловый (ректификат)

ГОСТ 18300-87

Спирт изоамиловый

ГОСТ 5830-79

Натрия гидроокись

ГОСТ 4328-77

Двуокись кремния с размером частиц 0,5 - 10,0 микрон

Фенол

Хлороформ

ГОСТ 1248-72

тРНК

Трис-(оксиметил)-аминометан

ТУ 6-09-4292-76

Тест-система для проведния полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуорисцентной детекцией в режиме реального времени или аналогичная

Тест-система ИФА для определения активности глутатион-S-трансферазы

Тест-система ИФА для определения активности глутатионпероксидазы

Тест-система биохимического анализа для определения активности глутатионредуктазы

Тест-система биохимического анализа для определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

Приложение 4
(справочное)

Пример апробации методики исследования показателей нарушения биотрансформации бензола в организме детей, проживающих в условиях хронического внешнесредового воздействия бензола

Результаты апробации предложенной методики показали: содержание бензола в атмосферном воздухе селитебной зоны по данным мониторинговых и натурных наблюдений в 2009 - 2010 гг. зафиксировано на уровне до 1,2 ПДКсс или 4 RfCchr.; отсутствие фенола в атмосферном воздухе, что исключает его экзогенное ингаляционное поступление в организм.

В результате химико-аналитического обследования детей, проживающих в условиях хронического внешнесредового воздействия бензола и отсутствия аэрогенного поступления фенола (группа наблюдения, п = 188), установлено, что у детей группы наблюдения, по сравнению с детьми, проживающими вне зоны аэрогенного воздействия исследуемых химических веществ (контрольная группа, п = 93), в крови регистрируется бензол в 55 % случаев от числа обследованных детей, в моче - в 64 % случаев (табл. 1).

Таблица 1

Содержание бензола и фенола в биосредах детей, мг/дм3

Вещество

Биосреда

Группа наблюдения

Контрольная группа

Достоверность различий (р ≤ 0,05)

Бензол

кровь

0,0182 ± 0,0025

нпо*

0,000

Фенол

0,118 ± 0,031

0,011 ± 0,008

0,004

Бензол

моча

0,0105 ±0,0046

нпо*

0,000

Фенол

0,291 ±0,097

0,208 ± 0,069

0,000

нпо* - ниже предела обнаружения: нпо бензола - 0,0035 мг/дм3.

При идентификации вещества в крови детей группы наблюдения ниже предела обнаружения в расчете средней концентрации использована 1/2 предела обнаружения

Кроме этого, у 70 % детей группы наблюдения в крови установлена повышенная концентрация фенола, превышающая данный показатель у детей в группе сравнения в 10 раз. У 26 % детей группы наблюдения установлено повышенное содержание фенола в моче. При этом средняя концентрация данного соединения достоверно превысила в 1,4 раза аналогичный показатель у детей в группе сравнения.

При выполнении исследования состояния гена цитохрома Р-450, обеспечивающего первую фазу биотрансформации бензола, подсчитывали процент гомозигот и гетерозигот. Анализ полученных данных выявил наличие патологической гомозиготы у 4 % детей исследуемой группы при отсутствии таковой в контроле. При этом распространенность минорного аллеля у детей группы наблюдения превышала его частоту в контроле (10 и 6 % соответственно). Распределение частот генов цитохрома Р-450 CYP1A1 у детей представлены в табл. 2.

Таблица 2

Распределение частот генов цитохрома Р-450 CYP1A1 у детей

Показатель

Генотип

Группа наблюдения, %

Контрольная группа, %

Ген цитохорма Р-450 CYP1A1

А/А*

4 (3)

0(0)

A/G**

17 (32)

23 (21)

G/G***

81 (153)

77 (72)

G***

90

89

А*****

10

6

______________

* Патологическая гомозигота.

** Гетерозигота.

*** Нормальная гомозигота.

*** Нормальный аллель.

***** Патологический аллель (минорный, мутантный)

При исследовании и оценке показателей глутатионовой системы, обеспечивающих вторую фазу биотрансформации бензола, анализировали средние значения активности ферментов и частоты регистрации выявленных отклонений показателей в группе наблюдения и контрольной группе. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Таблица 3

Сравнительный анализ показателей функций глутатионовой системы у детей

Показатель

Группа наблюдения

Контрольная группа

Достоверность различий по средним значениям показателей (Р ≤ 0,05)

среднее значение в группе

(М ± т)

частота регистрации проб с отклонением от физиологической нормы, %

среднее значение в группе

(М ± т)

частота регистрации проб с отклонением от физиологической нормы, %

ниже

выше

ниже

выше

ГлПО, нг/см3

40,84 ± 4,15

21,7

17,4

30,64 ± 1,21

18,9

4,9

0,000

ГлР, Е/дм3

80,55 ± 3,09

1,61

35,48

47,58 ± 3,42

0,0

48,28

0,000

Гл-6-Ф, Едм3

3,18 ± 0,37

1,43

60,0

2,89 ± 0,43

18,2

9,1

0,308

ГлSTp, нг/см3

79,04 ± 15,86

23,1

19,2

200,11 ± 35,8

25,4

5,08

0,000

При выполнении исследования анализируются средние значения активности ферментов и частота регистрации выявленных отклонений показателей в группе наблюдения и контрольной группе.

У детей группы наблюдения среднее значение активности глутатионпероксидазы (40,84 ± 4,15) нг/см3 в сыворотке крови достоверно превысило в 1,3 раза значение данного показателя у детей в контроле. При этом частота регистрации проб с повышенной активностью глутатионпероксидазы (17 % случаев от общего количества обследованных детей) в 4 раза превысила показатель в контрольной группе, что свидетельствует о реализации функции глутатионпероксидазы - защита глутатиона от окислительного повреждения бензолом.

Средняя активность глутатионредуктазы в сыворотке крови детей группы наблюдения составила (80,55 ± 3,09) Е/дм3, что в 1,7 раза выше данного показателя у детей контрольной группы. Доля проб с повышенной активностью глутатионредуктазы у детей группы наблюдения составила 35 % от общего количества обследованных, что достоверно в 1,4 раза ниже частоты регистрации повышенной активности данного фермента у детей контрольной группы (р = 0,000). Зарегистрирована повышенная активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови детей группы наблюдения в 60 % случаев, что в 7 раз выше данного показателя в контрольной группе.

Отмечается дисфункция глутатион-S-трансферазы в виде снижения ее активности у детей группы наблюдения (79.04 ± 15,86) нг/см3 в 2,5 раза относительно аналогичного показателя у детей контрольной группы, что свидетельствует о низкой конъюгации глутатиона с промежуточным метаболитом бензола - фенолом.

Полученные результаты свидетельствуют о сохранении функции ферментов глутатионовой системы, обеспечивающих восстановление глутатиона для дальнейшего связывания его с фенолом, и нарушении процесса конъюгации и выведения фенола из организма, что может привести к его накоплению в биосредах.

Учитывая выявленную дисфункцию глутатион-S-трансферазы для подтверждения нарушения процесса биотрансформации бензола, необходимо в дальнейшем оценивать состояние гена данного фермента - GSTP1 (A313G, C341G), ответственного за вторую фазу детоксикации бензола. То есть, для определения степени распространенности наследственно-обусловленных генетических изменений у лиц, подвергающихся хроническому внешнесредовому аэротехногенному воздействию бензола (для последующего исключения их из исследований), необходимо оценивать состояние гена цитохрома Р-450 CYP1A1 (T6235C-9893A/G), ответственного за первую фазу детоксикации, и гена GSTP1 (A313G, C341G), ответственного за вторую фазу детоксикации.

Накопление бензола и фенола в крови и моче может привести к развитию неинфекционных соматических заболеваний критических органов и систем. Выполненная оценка заболеваемости обследованных детей группы наблюдения показала, что частота регистрации анемии (23 % случаев от общего числа обследованных) и астеноневротического синдрома (19 %) превышает в 1,3 и 1,7 раза соответственно встречаемость аналогичных заболеваний у детей контрольной группы (16 и 10 % соответственно). Достоверно установлена причинно-следственная связь между содержанием бензола в атмосферном воздухе и уровнем заболеваемости детей анемией (OR = 1,3; DI = 1,11 - 3,38), астеноневротическим синдромом (OR = 2,40; DI = 1,80 - 4,23).

Полученные результаты свидетельствуют о нарушении процесса биотрансформации бензола в организме детей, проживающих в условиях внешнесредового аэрогенного воздействия.

221
Мне нравится
Комментировать Добавить в закладки

Комментарии могут оставлять только зарегистрированные пользователи.

Пожалуйста зарегистрируйтесь или авторизуйтесь на сайте.