ФЕДЕРАЛЬНАЯ
СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
ЛАБОРАТОРНЫЙ СОВЕТ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ
ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ
ОЦЕНКИ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ С
ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА
Методические рекомендации
№ 01.038-08
Москва
2008
Методические рекомендации разработаны ФГУЗ «Центр гигиены и
эпидемиологии в г. Москве» (Завьялов Н.В., Клочкова С.И., Скворцова Е.Л.), МГУ
им. М.В. Ломоносова (Данилов В.С., Юдина Т.П.)
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный
врач ФГУЗ «Федеральный центр гигиены
и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека
Председатель
Лабораторного Совета Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
_________________________________
А.И. Верещагин
«20»
ноября 2008 г.
|
Экспресс-метод
токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической
продукции с помощью люминесцентного бактериального теста
Методические рекомендации содержат описание метода
токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с
применением в качестве тест-объекта реактива люминесцентных бактерий «Эколюм» и
определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции жидкие
пеномоющие средства (пена для ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло),
шампуни для волос и тела; дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке,
парфюмерные жидкости (туалетная и парфюмерная вода, духи, одеколон, лосьоны
после бритья и пр.), водно-спиртовые, пропиленгликолевые экстракты,
ароматические экстракты, масляные экстракты, жиросодержащие косметические
средства (лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко), кремы
косметические, лаки маникюрные и средства для ухода за ногтями.
Методические рекомендации предназначены для скрининговой
оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции с учетом
общетоксического и раздражающего действия.
Методика может быть применена в качестве самостоятельного
экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.
Методические рекомендации предназначены для учреждений
Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ, учреждений
научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку
новых видов ПК продукции и контроль ее качества.
Результаты исследования качества ПК продукции учитывают при
определении уровня их возможного прямого или косвенного влияния на здоровье
человека.
1 Закон РСФСР «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»
от 19 апреля 1991 г.
2 «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании», утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации
от 5 июня 1994 г № 625.
3 Руководство Р
1.1.001-96 «Общие требования к построению, изложению и оформлению
нормативных и методических документов системы государственного
санитарно-эпидемиологического нормирования».
4 Руководство Р
1.1.003-96 «Общие требования к организации разработки нормативных и
методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического
нормирования».
5 ГОСТ
Р 1.5-92 «Государственная система стандартизации Российской Федерации.
Общие требования построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов».
6 СанПиН
1.2.681-97 «Гигиенические требования к производству и безопасности
парфюмерно-косметической продукции».
7 МУ
05РЦ/3140 «Методические указания по проведению токсикологических
исследований ингредиентов косметических средств в эксперименте на животных».
8 МР 11-1/131-09 «Определение токсичности химических
соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального
теста».
Экотоксикологический государственный контроль
осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества
окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные
объекты.
Химическое загрязнение воды - изменение химического
состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной
деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для
здоровья населения.
Токсичность - степень проявления ядовитого действия
разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных
факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно
дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее
использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы
контроля при стандартном анализе воды.
Критерий токсичности (индекс токсичности) -
достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого
делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто
используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и
метаболической активности организмов.
Тест-реакция - это изменение какого-либо
биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя
у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование - проведение анализов по определению
токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об
опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов,
причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и
не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами
биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и
дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических
компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на
физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой
области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую
метаболическую активность организмов
В качестве тест-объекта используются препараты «Эколюм»
лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты
бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения
интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических
веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные
бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных
структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи
метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и
количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие
токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат
фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических
связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для
экспрессных и количественных измерений.
Критерием токсического действия является измерение с помощью
прибора «Биотоке-10» интенсивности биолюминесценции тест-объекта под
воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по
сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой.
Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
При изучении токсикологических свойств ПК продукции и ее химических
ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с
их действием на высшие животные, метод Драйзе, культуры клеток человека,
подкожной адсорбции, фототоксичности и т.п.
Токсическое действие исследуемой пробы определяется по
ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-ти минутный (в
экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки
тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности «Т»
и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности «Т», равный отношению Т = 100(Iо - I)/Iо,
где Iо и I соответственно интенсивность
биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой
пробы с бактериальным препаратом.
Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности
1) допустимая степень токсичности образца индекс токсичности
Т меньше 20,
2) 2) образец токсичен индекс Т равен или больше 20 и меньше
50,
3) образец сильно токсичен индекс токсичности Т равен или
более 50. Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также
посредством измерения Iо и I, позволяют
быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо
токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или
ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным
(величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим
соединением - концентрация), вызывающий тушение свечение биосенсора на 50 % по
сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс
токсичности равен 50) ЕС20 есть эффективный объем образца, (в опытах с чистым
химическим соединением - концентрация) который приводит к 20 %-ному тушению
свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен
(индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют
о том, что образец безвреден для человека.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием
гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения
потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и
описывается формулой G = (Io - I)/I, где Iо
и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция G
очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции
графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая
или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График G-функции в
логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или
концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности
реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими
эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр «Биотоке-10» позволяет представлять
величины G для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и
ЕС50.
Количественным параметром токсичности ПК продукции является
степень разбавления образца по отношению к исходному продукту, приводящая к
величине параметров ЕС20 (токсичности) и ЕС50 (острой токсичности).
Количественным параметром оценки качества ПК продукции по сравнению с эталоном
этой продукции, оценки ингредиентов ПК продукции и оценки фототоксичности ПК
продукции служит индекс токсичности.
Измерительный прибор - люминометр типа «Биотоке-10» с
набором кювет на 1,5 мл Лиофилизированная культура микроорганизмов «Эколюм» или
ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01
Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг,
ГОСТ
24104-88
pH-метр, ГОСТ 25.7416.01-71 или аналоги
Сушильный электрический шкаф, ГОСТ
13474
Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4
°С
Пробирки с притертыми пробками объемом 3 - 5 мл, ГОСТ
1770-74
Дозаторы пипеточные на объемы 1,0 - 0,1 мл
Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ
1770
Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100
Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80 или обеззоленные типа ФОБ,
ТУ 6-09-1678
Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709
Кислота соляная, ГОСТ 3118
Натрия гидроокись, ГОСТ 4328
Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ
4174
Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710
Кислота серная, ГОСТ 4204
Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные
люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную
люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01.
Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При
температуре 2 - 4 °С и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1
года.
Специализированный люминометр «Биотокс-10» является
измерительным прибором, предназначенным для проведения
токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с
использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии «Эколюм». Сочетание
биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет
обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических
соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология
отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической
экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор «Биотокс-10» может осуществлять следующие
функции в автоматическом режиме определение интенсивности биолюминесценции
тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса
токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности,
определения величин ЕС20 и ЕС50 -пороговых значений допустимой степени и острой
степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия
токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для
оператора при превышении пробой допустимого уровня токсичности
При работе с химическими веществами необходимо соблюдать
требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В
конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается
по ГОСТ
12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям
пожарной безопасности по ГОСТ
12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ
12.4.009.
Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии
не патогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю
использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °С в течение
1 часа.
Хранить тест-культуру «Эколюм» в холодильнике при
температуре от -18 °С до +4 °С, следует беречь культуру лиофилизированных
бактерий от нагревания и резкой смены температуры.
Определение токсичности по настоящей методике выполняется
оператором с квалификацией лаборант, имеющий опыт работы в области
токсикологии.
Биотестирование проводится в нормальных лабораторных
условиях в соответствии с ГОСТ
15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.
Температура окружающего воздуха в лаборатории от +18 до 25
°С. Относительная влажность воздуха 80 ± 5 %. Атмосферное давление 84 - 106 кПа
(630 - 800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного
тока 50 ± 1 Гц. Напряжение сети 220 ± 10 В.
Освещение помещения естественное или искусственное, не
ограничивается особыми требованиями.
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению
биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных
проб, а также подготовку рабочего места для обработки проб и исследования их на
токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить
попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый
образец.
Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб
и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью
бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно
смачиваются хромовой смесью, после чего на 2 - 3 час посуда оставляется, затем
она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой
соды и промывается 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не
разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и
органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а
используемую для биотестирования, за исключением мерной, - в сушильном шкафу
при 105 °С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться
с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в
защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах
и т.п.
Извлечение водорастворимых форм химических соединений из ПК
продукции. Экстракты из образцов готовят путем настаивания в дистиллированной
воде. Соотношение веса или объема образца и объема воды, а также
продолжительность экстракции приведены в таблице 1. В сосуд помещают объем жидкого образца (или навеску
порошкового образца), заливают определенным объемом дистиллированной воды
(комнатная температура, pH 7,0 - 7,4) и выдерживают определенное время.
ПК продукция, представленная маслосодержащие средствами и
кремами, требует периодического перемешивания в течение времени экстракции. В
данных случаях после 1 часа экстракции осторожно отбирают водную фазу. Водную
экстракцию из жиросодержащих косметических средств удобно проводить в воронках
делительных, поскольку сливается нижняя водная фаза.
Средства для ухода за ногтями требуют предварительной
подготовки. На предметное стекло (2см×2см) ровным слоем наносят
исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до
полного высыхания. Подсушенный образец средства для ногтей помещают в сосуд с
дистиллированной водой (комнатная температура, pH 7,0 - 7,4). Объем воды и
время экстракции приведены в таблице 1.
После приготовления водных экстрактов из ПК продукции
проводят их дополнительное разведение дистиллированной водой, получая по 4
пробы при следующих отношениях экстракт вода 1:1 (первичное разведение,
приведено в таблице 1), 1:2, 1:4 и 1:8.
Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Например, отбирают в пробирку с пробкой 5 мл первичного
разведения шампуня (разведение 1:1), добавляют 5 мл дистиллированной воды и
тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:2. Затем в другую
пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и
тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:4. Потом в другую
пробирку отбирают 5 мл этого экстракта и добавляют 5 мл дистиллированной воды и
тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:8.
Таблица 1
Условия приготовления водных экстрактов в зависимости от вида
продукции
Вид
ПК продукции
|
Масса
или объем образца
|
Объем
дистиллированной воды, мл
|
Первичная
степень разведения
|
Продолжительность
экстракции
|
Жидкие пеномоющие средства (пена для
ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло), шампуни для волос и тела
|
1
мл
|
20
|
1:20
|
10
мин
|
Жиросодержащие косметические средства
(лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко), ароматические экстракты,
масляные экстракты
|
0,1
мл или 0,1 г
|
100
|
1:1000
|
1
час
|
Спиртосодержащая продукция (лосьоны,
одеколоны, духи, туалетная и парфюмерная вода)
|
1
мл
|
20
|
1:20
|
10
мин
|
Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной
упаковке
|
0,1
мл
|
100
|
1:1000
|
10
мин
|
Кремы косметические
|
1 г
|
10
|
1:10
|
1
час
|
Средства для ухода за ногтями(лаки, базы
и основы под лак, укрепители и пр.)
|
1 г
|
20
|
1:20
|
1
час
|
При исследовании отдельных ингредиентов
ПК продукции необходимо сделать 4 последовательных разведения дистиллированной
водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт вода 1:1, 1:2, 1:4
и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Не допускается консервирование проб, предназначенных для
исследования на токсичность.
Подготовка прибора «Биотокс-10».
Подготовку прибора «Биотокс-10» проводят в соответствии с
инструкцией по эксплуатации.
Регидротация биосенсора «Эколюм».
Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом «Эколюм».
Добавить 10 мл дистиллированной воды, pH 7,0 - 7,4 комнатной температуры для
получения суспензии бактериального препарата. Желательно использовать
стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть
флакон с суспензией препарата.
Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата
перед отбором определенных объемов для проведения анализа.
Выдержать суспензию в течение 30 минут.
Определение рабочей концентрации биосенсора «Эколюм».
Измерить фоновое значение прибора «Биотоке-10» (по
инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.
Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету
люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4,
комнатная температура).
Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить
величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий
должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25 - 250
раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий
дистиллированной водой и повторить измерение.
Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он
стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более
энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный
фильтр.
В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем
смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл
дистиллированной воды (pH 7,0 - 7,4). При приготовлении опытных образцов к 0,1
мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК продукции различного
разведения. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть
одинаковой.
Измерение токсикологических параметров проводят с помощью
прибора «Биотоке-10» в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В
экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.
При исследовании ПК продукции после вывода прибора в режим
измерения ЕС определяется интенсивность свечения контрольной кюветы и 4-х проб,
полученных путем разбавления исследуемой пробы дистиллированной водой в
следующих отношениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4-х проб автоматически
определяется G-функция, значения которой заносятся в оперативную память
микроконтроллера прибора. По данным этих измерений микроконтроллер при нажатии
специальной кнопки клавиатуры управления производит автоматически вычисление
коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее. При исследовании
коэффициентов ЕС ингредиентов ПК продукции рекомендуется убедиться при
измерении токсичности приготовленного раствора, что величина G для данной пробы
не превышает значения 25. В случае если величина больше, может увеличиться
погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу
дистиллированной водой.
Как при исследовании ПК продукции, так и ингредиентов, после
определения, путем измерения величины ЕС20 - насколько надо разбавить раствор,
чтобы он стал не токсичным, необходимо учесть вклад этапа предварительного
разбавления.
Следует обратить внимание, что при интенсивности
биолюминесценции опыта больше или равным контроля вычисление G-функции не
производится. В этом диапазоне образец не токсичен. Следует уменьшить степень
первичного разбавления.
Для большей достоверности проведения измерений рекомендуется
делать несколько параллельных разбавлений исходного образца.
В случае наличия эталонного образца ПК продукции
исследования качества продукции проводятся по сравнению опытного и эталонного
образцов. Водная экстракция из эталонного образца проводится, как указано выше,
и этот раствор используется как контроль. Условия экстракции должны быть строго
одинаковыми в контроле и опыте.
Измеряется свечение, эталонной пробы и прибор запоминает эту
величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически
фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы и усредненную величину
индекса токсичности. В этом анализе параметры ЕС не измеряются.
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию
в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению
индекса токсичности «Т». Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции
контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений
прибора «Биотокс-10».
Рекомендуется измерять три повторности водного экстракта
ингредиента. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем
расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности «Т» по
формуле Т = (Т1 + Т2 + Т3)/3, где Т1
- Т3 - повторности опытной пробы. Величины T1, Т2
и Т3 получают при измерении последовательности контроль, и затем
серия опытных образцов.
Прибор «Биотокс-10» автоматически определяет усредненный
показатель индекса токсичности и погрешность измерения. Если погрешность
измерения большая, необходимо увеличить число повторностей.
В случае определения токсичности пробы при малых разведениях
можно определить насколько это связано со значениями pH исследуемого раствора.
Для этого измеряют pH пробы и, если величина pH находится за пределами 6,5 -
8,0, приводят pH до значений 7,0 - 7,4 и повторяют измерение токсичности.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность
биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае
независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии
токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
При исследовании фототоксичности ПК продукции образцы
предварительно подвергают освещению светом с длиной волны 300 - 750 нм и
мощностью 5 дж/см2 в течение 60 мин.
Дальнейшие приготовления водных экстрактов и измерение
токсичности образцов проводят, как описано выше (п. 10.2). В качестве контроля
используют водный экстракт из необлученной ПК продукции.
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию
в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению
индекса токсичности «Т» и параметров ЕС20 и ЕС50.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность
биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае
независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии
токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
По величине индекса токсичности анализируемой пробы
классифицируются на три группы (Таблица 2).
Таблица 2
Группы
|
Величина
индекса токсичности «Т»
|
Вывод
о степени токсичности Пробы
|
1
|
меньше
20
|
допустимая
степень токсичности
|
2
|
от
20 до 50
|
образец
токсичен
|
3
|
равно
или больше 50
|
образец
сильно токсичен
|
Количественные оценки токсичности
ПК продукции (параметр ЕС20), ингредиентов и фоточувствительности ПК продукции
(индекс токсичности) представлены в таблице 3.
Таблица 3
Количественные параметры оценки токсичности ПК продукции
Вид
продукции
|
Т
|
ЕС20
|
Жидкие пеномоющие средства (пена для
ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло), шампуни для волос и тела
|
|
1:100
|
Спиртосодержащая продукция (лосьоны, одеколоны,
духи, туалетная и парфюмерная вода)
|
|
1:100
|
Жиросодержащие косметические средства
(лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко), ароматические
экстракты, масляные экстракты
|
|
1:4000
|
Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной
упаковке
|
|
1:8000
|
Кремы косметические
|
|
1:100
|
Средства для ухода за ногтями(лаки, базы
и основы под лак, укрепители и пр.)
|
|
1:100
|
Ингредиенты ПК продукции
|
20
|
Концентрация,
вызывающая ЕС20
|
Сравнение ПК продукции и ингредиентов с
эталонным образцом
|
20
|
|
Фототоксичность ПК продуктов
|
20
|
|
ПК продукция признается токсичной,
если согласно параметру ЕС20 необходимо большее разбавление, нежели указано в
таблице 3. При достижении параметра ЕС50
продукция признается сильно токсичной.
При определении токсичности ингредиента ПК продукции нужно
сопоставить концентрацию, вызывающую ЕС20, с концентрацией этого ингредиента в ПК
изделии. Если она больше, то необходимы дополнительные анализы с применением
других методов для заключения о возможности использования ингредиента.
В случае выявления дополнительной токсичности ПК продуктов
после освещения необходимы дополнительные анализы с применением других методов.
При обнаружении отличия ПК продукции и ингредиентов от
эталонных образцов на величину большую Т = 20 следует провести дополнительные
исследования качества продукции другими методами.
Результат токсикологического анализа представляется в виде
протокола (Приложение 1).
Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей
среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к
модельному «эталонному» токсиканту цинку сернокислому 7-водного (ZnSO47H2O). Расчет
проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного
токсиканта, при действии которого в течение 30 минут интенсивность
биолюминесценции ингибируется на 50 %, составляет 0,6 - 1,5 мг/л.
Удовлетворительные результаты, полученные при проверке
диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не
обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты
и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить
ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые
в условиях проведения опытов.
Процедура определения диапазона реагирования тест-системы
«Эколюм» на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего
4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 минут с биосенсором.
Должно происходить не менее чем 50 %-ное ингибирование интенсивности биолюминесценции
по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует
проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения
опытов. Если все правильно, то биосенсор не используется.
Результат токсикологического
анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование,
представляется в виде
x̄ -
среднее арифметическое определений,
За результат анализа (
) принимают среднее арифметическое
результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса
токсичности. Индекс токсичности Т вычисляется по формуле Т = 100 (Iконтр - Iопыт)/Iконтр, где Iконтр
и Iопыт соответственно интенсивности
биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.
Среднее квадратичное отклонение
(σ) результатов определений количественного выражения тест-реакции -
индекса токсичности вычисляется по формуле
где xi - i-й результат
определений, n - число параллельных определений.
Среднее арифметическое
результатов определений
количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле
Все указанные статистические
параметры вычисляются измерительным прибором «Биотокс-10» автоматически по
команде оператора.
Приложение 1 (рекомендуемое)
наименование
учреждения, выдавшего протокол
|
ИСПЫТАТЕЛЬНЫЙ
ЦЕНТР
|
Аттестат аккредитации
Регистрация в реестре
ПРОТОКОЛ № ___
определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм»
и прибора «Биотоке-10»
Наименование учреждения/отдела
токсикологической оценки
___________________________________
вид испытаний
|
___________________________________
№ образца
|
от «__»
___________ 2004 г.
Наименование образца ______________________________________________________
Наименование
предприятия-изготовителя: ___________________________________
Наименование заявителя
(отдела): ___________________________________________
Упаковка, маркировка, описание
образца ____________________________________
НД на методы испытаний: __________________________________________________
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИСПЫТАНИЙ
Показатели токсичности
|
Критерии оценки
|
Вывод о степени токсичности пробы
|
Индекс токсичности:
|
меньше 20
- допустимая степень токсичности,
от 20 до 50 - образец токсичен,
равно или больше 50 - образец сильно токсичен.
|
|
Средняя величина ЕС20
|
|
|
Испытания проведены:
|
_____________________________
(Ф. И. О лиц, проводивших испытание)
|
__________________
(дата)
|
Заключение,
рекомендации:
Вывод о токсичности образца
_________________________________________________
___________________________________________________________________________
Результаты испытаний
распространяются только на представленные образцы
Частичная перепечатка протокола
запрещена
Ответственный
специалист
|
Форма
регистрации условий и результатов биотестирования ПК продукции по
сравнению с эталоном, фототоксичности ПК продукции
ПРОТОКОЛ
№ ___
определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм»
Наименование организации
|
|
Наименование пробы
|
|
Дата, время приготовления пробы
|
|
Дата измерения проб
|
|
Число повторностей измерения проб
|
|
Результаты биотестирования
Усредненный индекс токсичности
|
|
Погрешность измерения
|
|
Оценка токсичности пробы
|
|
Оператор, Ф. И. О
|
|
|