На главную
На главную

Микробиологическое измерение концентрации Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания

Методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания носят рекомендательный характер.

Обозначение: МУК 4.2.3257-14
Название рус.: Микробиологическое измерение концентрации Yarrowia lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания
Статус: введен впервые
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 12.02.2016
Утвержден: 30.12.2014 Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Опубликован: Роспотребнадзор (2015 г. ) Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора (2015 г. )
Ссылки для скачивания:

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций штаммов
микроорганизмов в атмосферном воздухе
населенных мест

Сборник методических указаний

МУК 4.2.3249-14

МУК 4.2.3251-14

МУК 4.2.3253-14

МУК 4.2.3255-14

МУК 4.2.3257-14

Выпуск 1

Москва 2015

1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6.11.2014 № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Назначение и область применения. 2

2. Биологическая характеристика штамма Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест. 3

3. Пределы измерений. 3

4. Методы измерений. 3

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 4

5.1. Средства измерений. 4

5.2. Вспомогательные устройства и материалы.. 4

5.3. Реактивы и питательные среды.. 5

6. Требования безопасности. 5

7. Требования к квалификации операторов. 5

8. Условия измерений. 5

9. Приготовление питательных сред. 5

9.1. Глюкозо-пептонный агар (ГПА) 5

9.2. Желточный агар. 5

10. Проведение измерения. 6

10.1. Отбор проб воздуха. 6

10.2. Выполнение анализа. 6

11. Вычисление результатов измерения. 7

12. Оформление результатов измерений. 7

 

Введение

Сборник методических указаний «Измерение концентраций штаммов микроорганизмов в атмосферном воздухе населенных мест» (выпуск 1) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций микроорганизмов их предельно допустимым концентрациям (ПДК), что является обязательным при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.

Включенные в данный сборник методические указания по контролю биотехнологических штаммов в атмосферном воздухе населенных мест разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методики выполнены с использованием современных и адекватных микробиологических методов исследования и позволяют контролировать концентрации биотехнологических штаммов микроорганизмов на уровне и ниже их ПДК в атмосферном воздухе населенных мест, установленных в гигиенических нормативах.

Методические указания по измерению концентраций штаммов микроорганизмов в атмосферном воздухе населенных мест предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарно-микробиологических лабораторий промышленных предприятий, а также для научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований, для осуществления контроля за содержанием штаммов в атмосферном воздухе населенных мест.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

______________________ А.Ю. Попова

30 декабря 2014 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Yarrowia lipolytica 2
kp ВКПМ Y-4043
в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания
МУК 4.2.3257-14

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 5 000 клеток в 1 м3 воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Y. lipolytica 2kp
ВКПМ Y-4043 и его гигиенический норматив
в атмосферном воздухе населенных мест

Дрожжевая культура Yarrowia lipolytica 2kp выделена из загрязненных нефтепродуктами воды/стоков Московской области, природный изолят. Штамм отобран по способности эффективно снижать содержание нефти в загрязненной ею воде, песке и почвах. Растет на средах с гексадеканом и нефтью в качестве единственных источников углерода. Является компонентом биопрепарата по биоремедиации почв, грунтов, водоемов и стоков от нефти и нефтепродуктов.

По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей часть 18S рРНК исследуемого штамма установлено, что исследуемый штамм Yarrowia lipolytica (98 %).

Аэроб. Способен к росту на средах, содержащих источники углерода.

Мезофил. Рост очень хороший - через 24 ч при 25 - 28 °С образует колонии на глюкозо-пептонном агаре (ГПА). При температуре 42 °С не растет. Выдерживает концентрации хлорида натрия до 1 % и немного более.

Штамм растет на агаризованных средах (ГПА, МПА, АГВ-среда, картофельный агар (КА). Можно культивировать в LB-бульоне и на LB-агаре или глюкозо-минеральной среде (ГПС).

На ГПА на 1 - 2-е сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр - 10 - 12 мм.

Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение - многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 - 4 аскоспоры, шаровидные, полусферические или шляповидные.

Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде Yarrowia один вид lipolytica, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа - Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.

Штамм Yarrowia lipolytica 2kp депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4043.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 50 кл/м3, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест клеток псевдомицелия и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст.

ТУ 2504-1799-75

Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг

ГОСТ Р 53228-08

Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2

ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3

ГОСТ 29227-91

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3

ГОСТ 1770

Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С

ТУ 25-2021.003-88

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

 

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С

ТУ 9452-010-00141798-02

Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) °С и (37 ± 2) °С

ТУ 9452-002-00141798-97

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Стерилизаторы паровые медицинские

ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02

Дистиллятор

ТУ 4952-007-33142130-2000

Облучатель бактерицидный настенный

ТУ 9444-015-03965956-08

Холодильник бытовой

ГОСТ 26678-85

Микроскоп биологический с иммерсионной системой

 

Лупа с увеличением ×10

ГОСТ 25706-83

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Спиртовки лабораторные стеклянные

ГОСТ 23932-90

Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов

ГОСТ 23932-90

Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм

ГОСТ 25336-82

Груша резиновая

ТУ 9398-005-0576-9082-03

Петля бактериологическая

 

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556-81

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-96

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-90

Глюкоза

ГОСТ 6038-79

Пептон сухой ферментативный

ГОСТ 13805-76

Спирт этиловый технический

ГОСТ 17299-78

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87

Натрий хлористый, хч

ГОСТ 4233-77

Глюкозо-пептонная среда стандартная

 

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

6.2. СП 1.3.2518-09 Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях

- температура воздуха (20 ± 5)°С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

9.1. Глюкозо-пептонный агар (ГПА)

Для приготовления используют сухую готовую глюкозо-пептонную среду: 50,0 г порошка размешивают в 1000 см3 дистиллированной воды. Можно использовать отдельные компоненты среды следующего состава (г/дм3): пептон - 20,0 г; глюкоза - 10,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; агар-агар - 15,0 г; дистиллированная вода - 1000 см3. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.

Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см3 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

9.2. Желточный агар

Для приготовления желточного агара смешивают указанные компоненты: пептон - 20 г, однозамещенный фосфорно-кислый натрий (Na2HPO4) - 2,5 г, хлорид натрия (NaCl) - 1 г, серно-кислого магния (MgSO4) 0,5 %-й раствор - 1 мл, глюкоза - 1 г, агар - 12,5 г, дистиллированная вода - 500 мл. Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин и охлаждают до 60°.

Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют до полного затвердевания.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (ГПА) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, с соблюдением правил асептики вносят стерильный раствор циклогексимида, из расчета 0,5 г/л среды (для подавления посторонней микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 ч. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1 - 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром. После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при (28 ± 2) °С в течение 48 - 72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

К = (П×1000)/С×Т, кл/м3, где

К - концентрация штамма в воздухе, клеток/м3;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма Y. lipolytica 2kp
ВКПМ Y-4043 в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа _________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) ___________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ____________________________________

3. Вид пробоотборника ____________________________________________________

4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ___________________________________________________________________________

5. Питательная среда, время инкубации ______________________________________

6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды __________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов Y. lipolytica 2kp ВКПМ Y-4043 (микроморфологические признаки) ____________________________________________

9. Результаты расчёта концентрации штамма __________________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. ____________________

11. Отбор пробы произведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись)

___________________________________________________________________________

12. Идентификация штамма и расчёт концентрации произведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________________________________________

 

121
Мне нравится
Комментировать Добавить в закладки

Комментарии могут оставлять только зарегистрированные пользователи.

Пожалуйста зарегистрируйтесь или авторизуйтесь на сайте.