Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха
Обозначение: | МУК 4.2.3033-12 |
Название рус.: | Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест |
Статус: | действует |
Дата актуализации текста: | 05.05.2017 |
Дата добавления в базу: | 01.09.2013 |
Дата введения в действие: | 20.07.2012 |
Утвержден: | 20.07.2012 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации |
Опубликован: | Роспотребнадзор (2012 г. ) |
Ссылки для скачивания: |
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Методы микробиологического измерения
концентрации клеток плесневого гриба
Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ
F-3972D - продуцента комплекса
карбогидраз в воздухе рабочей зоны и
атмосферном воздухе населенных мест
Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.2.3032-12; 4.2.3033-12
1. Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.
4. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Общие положения и область применения. 2 2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D и его гигиенический норматив. 2 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3 7. Требования к квалификации операторов. 4 10. Вычисление результатов измерения. 5 11. Оформление результатов измерений. 6 |
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г. Дата введения: с момента утверждения |
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации
клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum
PV2007 ВКМ F-3972D -
продуцента комплекса
карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.3033-12
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма P. verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов - ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K ВКМ F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3972D.
Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 - 30 °С в течение 7 - 10 суток, рН 4,5 - 5,0. При t 5 °С рост колоний не наблюдается.
На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 - 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 - 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии - палево-оранжевая.
При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 - 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 - 13 ´ 2,5 - 3,0 мкм, фиалиды амлуллиформные размером 7 - 8 ´ 2,8 - 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 - 3,5 мкм.
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
ТУ 9443-001-05031637-02 |
|
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) |
ТУ 64-12791-77 |
Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха |
|
Термостаты электрические суховоздушные или водяные |
|
Автоклав электрический |
ГОСТ 9586-75 |
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами |
|
Холодильник бытовой |
|
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 |
|
Лупа с увеличением ´10 |
ГОСТ 25706-83 |
Чашка Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 90 мм |
ГОСТ 23932-90 |
Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл |
ГОСТ 25336-82 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл |
ГОСТ 1770-74 |
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл |
ГОСТ 1770-74 |
Секундомер |
ГОСТ 9586-75 |
Барометр |
ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 25556-81 |
5.2. Реактивы, растворы
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.
6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».
6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».
6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками».
6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении (760 ± 20) мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °С. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.
При выполнении анализа воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5 %-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °С в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1 %-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.
Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, год. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
где
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.
Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин ´ t (время аспирации, мин).
Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма P. verruculosum
PV2007 ВКМ F-3972D в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа___________________________________________________ |
2. Рабочее место (профессия работающего)_________________________________________ |
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)_________________________________________________________________ |
4. Вид пробоотборника_______________________________________________________ |
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _________ |
6. Питательная среда, время инкубации_________________________________________ |
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.)______________________ |
8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ________________ |
9. Результаты расчёта концентрации штамма____________________________________ |
10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК ________________________ |
11. Отбор пробы произведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись) _______________________ |
12. Идентификация штамма и расчёт концентрации произведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________________________________________________________ |
1. РД 52.04.186-96 «Руководство по контролю загрязнения атмосферы». М., 1991, 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с.