На главную
На главную

Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха

Обозначение: МУК 4.2.3033-12
Название рус.: Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест
Статус: действует
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.09.2013
Дата введения в действие: 20.07.2012
Утвержден: 20.07.2012 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Опубликован: Роспотребнадзор (2012 г. )
Ссылки для скачивания:

Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методы микробиологического измерения
концентрации клеток плесневого гриба
Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ
F-3972D - продуцента комплекса
карбогидраз в воздухе рабочей зоны и
атмосферном воздухе населенных мест

Сборник методических указаний
по методам контроля

МУК 4.2.3032-12; 4.2.3033-12

Москва 2012

1. Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Общие положения и область применения. 2

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D и его гигиенический норматив. 2

3. Пределы измерений. 3

4. Метод измерений. 3

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3

6. Требования безопасности. 4

7. Требования к квалификации операторов. 4

8. Условия измерений. 4

9. Проведение измерения. 4

10. Вычисление результатов измерения. 5

11. Оформление результатов измерений. 6

Список литературы.. 6

 

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

20 июля 2012 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации
клеток плесневого гриба
Penicillium verruculosum
PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса
карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания

МУК 4.2.3033-12

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма P. verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов - ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K ВКМ F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3972D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 - 30 °С в течение 7 - 10 суток, рН 4,5 - 5,0. При t 5 °С рост колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 - 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 - 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии - палево-оранжевая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 - 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 - 13 ´ 2,5 - 3,0 мкм, фиалиды амлуллиформные размером 7 - 8 ´ 2,8 - 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 - 3,5 мкм.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Импактор микробиологический «Флора-100»

ТУ 9443-001-05031637-02

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)

ТУ 64-12791-77

Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением ´10

ГОСТ 25706-83

Чашка Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 90 мм

ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл

ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл

ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл

ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл

ГОСТ 1770-74

Секундомер

ГОСТ 9586-75

Барометр

ГОСТ 24696-79

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-84

D-Глюкоза (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций)

ГОСТ 6038-79

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат

ГОСТ 5962-67

Кислота молочная пищевая (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры)

ГОСТ 490-79

Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель - 200, агар - 18 - 20, рН 4,5 - 5,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза - 15 - 20 перед использованием)

Среда Гетчинсона, г/л (КН2РО4 - 0,1; NaCl - 0,1; СаСl2 - 0,1; FeCl3 - 0,1; MgSO4´2O - 0,3; NaNO3 - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода)

0,5 %-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость m 10 мПас, t 25 °С, вискозиметр Брукфильда LVF

0,1 %-й раствор Конго Красного (congo rot)

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».

6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками».

6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении (760 ± 20) мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °С. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.

При выполнении анализа воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5 %-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °С в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1 %-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, год. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:

 где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.

Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин ´ t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма P. verruculosum

PV2007 ВКМ F-3972D в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа___________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего)_________________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)_________________________________________________________________

4. Вид пробоотборника_______________________________________________________

5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб _________

6. Питательная среда, время инкубации_________________________________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.)______________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ________________

9. Результаты расчёта концентрации штамма____________________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК ________________________

11. Отбор пробы произведён (Ф. И. О., должность, дата, подпись) _______________________

12. Идентификация штамма и расчёт концентрации произведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________________________________________________________

Список литературы

1. РД 52.04.186-96 «Руководство по контролю загрязнения атмосферы». М., 1991, 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с.

100
Мне нравится
Комментировать Добавить в закладки

Комментарии могут оставлять только зарегистрированные пользователи.

Пожалуйста зарегистрируйтесь или авторизуйтесь на сайте.