4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
метаболитов флоникамида в яблоках
и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной
хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3325-15

Москва 2016

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств метаболитов
флоникамида в яблоках и яблочном соке методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.195/01.00043/2015 от 01.06.2015

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств метаболитов флоникамида (TFNG и TFNA) в яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Метаболиты флоникамида

TFNG

N-((4-Трифторметил-3-пиридинил)карбонил)глицин (IUPAC).

C₉H₇F₃N₂O₃

Молекулярная масса: 248,2.

TFNA

4-Трифторметилпиридинил-3-карбоновая кислота (IUPAC).

C₇H₄F₃NO₂

Молекулярная масса: 191,1.

В России для TFNG и TFNA гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 и 2, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры для TFNG

Таблица 2

Метрологические параметры для TFNA

Таблица 3

Полнота извлечения TFNG, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата

Таблица 4

Полнота извлечения TFNA, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении TFNG и TFNA методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после их извлечения из образцов буфером, очистки в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистке на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.2.2. Для приготовления 0,005 М гидроксида натрия в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 0,2 г натрия гидроокиси и доводят объем водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.2.3. Для приготовления 1 N раствора соляной кислоты в мерную колбу объемом 10 см³ помещают 1,7 мл концентрированной соляной кислоты и доводят объем водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 месяцев.

7.2.4. Для приготовления 0,1 N раствора соляной кислоты в мерную колбу объемом 10 см³ помещают 1,0 мл 1 N раствора соляной кислоты и доводят объем водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 месяцев.

7.2.5. Для приготовления 0,2 N раствора соляной кислоты в мерную колбу объемом 10 см³ помещают 2 мл 1 N раствора соляной кислоты и доводят объем водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 месяцев.

7.2.6. Для приготовления 0,1 М фосфатного буфера взвешивают 11,4 г двузамещенного трехводного фосфорнокислого калия и 6,8 г дигидроортофосфата калия, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в воде и доводят объем до метки водой. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основные растворы с концентрацией 1,0 мг/см³: точные навески TFNG и TFNA (50 ± 0,5 мг) помещают в разные мерные колбы вместимостью 50 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы готовят как смесь TFNG и TFNA с концентрациями по каждому 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 10,0 мкг/см³ методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя воду.

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 10 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 3,0 см³ основного раствора TFNG и 1,0 см³ основного раствора TFNA и доводят до метки водой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 8 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,8 см³ основного раствора TFNG и 0,8 см³ основного раствора TFNA и доводят до метки водой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 4 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,4 см³ основного раствора TFNG и 0,4 см³ основного раствора TFNA и доводят объем до метки водой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки водой.

7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки водой.

Основные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения TFNG и TFNA в яблоках и яблочном соке используют эти же растворы.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация TFNG и TFNA в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии для каждого из веществ:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации TFNG или TFNA в градуировочном растворе,

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации TFNG или TFNA в градуировочном растворе,

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.5. Подготовка патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают последовательно 3 см³ метанола, 3 см³ воды, 3 см³ 0,1 N соляной кислоты и 3 см³ воды, после чего они готовы к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения TFNG и TFNA
на патроне для твердофазной экстракции

В кругло донную колбу емкостью 10 см³ отбирают по 1 см³ стандартных растворов TFNG и TFNA в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ 0,005 М раствора гидроксида натрия и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Промывают патрон 1 см³ 0,005 М раствора гидроксида натрия, элюат отбрасывают. TFNG и TFNA элюируют 0,2 N соляной кислотой со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие TFNG и TFNA, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень веществ в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения TFNG и TFNA следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы яблок и яблочного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °С, в холодильнике сок хранят при температуре 0 - 4 °С в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1. Определение TFNG и TFNA в яблоках

Пробу измельченных яблок (20 г) помещают в коническую плоскодонную колбу объемом 100 см³, добавляют 30 см³ 0,1 М фосфатного буфера и помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Надосадочную жидкость декантируют и повторяют экстракцию тем же количеством буфера. Объединенные экстракты подкисляют 1 N соляной кислотой до pH 2 (индикаторная бумага), добавляют 10 г хлорида натрия, переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 20 см³. Органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток очищают на патроне по п. 9.3.

9.2. Определение TFNG и TFNA в яблочном соке

Навеску 20 г яблочного сока разбавляют до 60 см³ водой, подкисляют 1 N соляной кислотой до pH 2, добавляют 10 г хлорида натрия, переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 20 см³. Органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток очищают на патроне по п. 9.3.

9.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный в п. 9.1 - 9.2, растворяют в 1 см³ 0,005 М раствора гидроксида натрия и количественно переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу ополаскивают 1 см³ 0,005 М раствора гидроксида натрия и также наносят на патрон. Промывают патрон 3 см³ 0,005 М раствора гидроксида натрия. TFNG и TFNA элюируют 5 см³ 0,2 N соляной кислоты. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ воды и анализируют по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, содержащей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 1:99, по объему. Скорость потока элюента - 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора - 265 нм. Объем вводимой пробы - 10 мм³. Время удерживания для TFNG - (13,2 ± 0,2) мин, для TFNA - (9,7 ± 0,2) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание метаболита в пробе (X_i, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_xi- площадь пика метаболита на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K_i - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств TFNG и TFNA в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Для пересчета содержания флоникамида с учетом метаболитов (X) в эквиваленте действующего вещества, с учетом коэффициента, определяемого по соотношению молекулярных масс соединений k₁ (TFNG) = 229/248 и k₂ (TFNA) = 191/229, используют формулу:

Х₀ - содержание флоникамида без учета метаболитов;

k₁⋅X₁ - содержание флоникамида с учетом метаболита TFNG;

k₂⋅X₂ - содержание флоникамида с учетом метаболита TFNA.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы с концентрацией 10,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения TFNG в яблоках).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х′) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

′, Х, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.