Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование
Российской Федерации
4.1.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
гекситиазокса в зеленой массе, бобах и
масле сои методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3324-15
Москва
2016
1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты
растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный
центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря
2015 г. № 2).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.
4. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель
Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
А.Ю.
Попова
28
декабря 2015 г.
|
4.1.
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств гекситиазокса
в зеленой массе, бобах и масле сои методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3324-15
Свидетельство о метрологической
аттестации № 01.5.04.196/01.00043/2015 от 01.06.2015
Настоящие методические указания устанавливают порядок
применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения
остаточных количеств гекситиазокса в диапазонах: в бобах и масле сои 0,05 - 0,5
мг/кг, в зеленой массе 0,1 - 1,0 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Гекситиазокс
(4RS,5RS)-5-(4-C]orophenyl)-N-cyclohexyl-4-methyl-2-oxothiazolidine-3-carboxamide (ИЮПАК)

C17H21ClN2O2S
Молекулярная масса: 352,6.
Химически чистое вещество представляет собой бесцветные
кристаллы.
Температура плавления: 108,0 - 108,5 °С.
Давление пара при 20 °С: 0,0034 мПа.
Растворимость: в воде - 0,5 мг/дм3 (при 20 °С), в
хлороформе - 1379, метаноле - 206, ацетоне - 160, ацетонитриле - 28,6, гексане
- 4 (г/дм3, при 20 °С).
Стабильность: стабилен к воздействию света, воздуха,
нагревания до 300 °С, в кислых и щелочных средах. Для водных растворов на свету
DT50 = 16,7 дней.
Краткая токсикологическая характеристика. Острая
пероральная токсичность LD50 для крыс и мышей > 5000 мг/кг,
острая дермальная токсичность LD50 для крыс превышает 5000 мг/кг.
Ингаляционная токсичность LC50 (4 часа) для крыс - более 2 мг/м3
воздуха. Оказывает раздражающее действие на слизистую глаз, не оказывает - на кожу.
Класс опасности по ВОЗ - U. Не токсичен для пчел.
Область применения препарата. Акарицид с овицидной,
ларвицидной и нимфацидной активностью в отношении многих видов фитофаговых
клещей на плодовых, цитрусовых, овощных культурах, винограде и хлопке.
Гигиенические нормативы для гекситиазокса в России: ВМДУ
хлопчатник (семена - 0,5, масло - 0,1 мг/кг), для сои не установлен.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения
анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее
составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не
превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов
концентраций.
Метод основан на определении гекситиазокса методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора
после его экстракции из образцов зеленой массы, бобов и масла сои
ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патронах
для твердофазной экстракции.
Идентификация гекситиазокса проводится по времени
удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий
подготовки проб и хроматографирования.
Жидкостный хроматограф с
УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и
термостатом колонки
|
|
Весы аналитические с пределом
взвешивания до 210 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 мг
|
ГОСТ
53228-08
|
Весы технические с пределом
взвешивания до 150 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 г
|
ГОСТ
53228-08
|
Колбы мерные на 10, 100 см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Микродозаторы одноканальные
переменного объема от 100 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3
|
|
Цилиндры мерные на 50 и 100 см3
|
ГОСТ
23932-90
|
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными
или лучшими характеристиками.
Ацетонитрил для ВЭЖХ
|
ТУ 2634-002-04715285-12
|
Вода для лабораторного анализа
(бидистиллированная, деионизованная)
|
ГОСТ Р 52501-05
|
Гекситиазокс с содержанием
основного вещества 99,9 %
|
|
Кислота ортофосфорная, хч
|
ГОСТ
6552-80
|
Магний сернокислый, безводный, хч
|
ГОСТ 4523-67
|
н-Гексан, хч
|
ТУ 2631-003-05807999-98
|
Натрий хлористый, чда
|
ГОСТ
4233-77
|
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь
ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10
|
|
Смесь № 1: гексан-этилацетат в
соотношении 4:1 по объему
|
|
Смесь № 2: гексан-этилацетат в
соотношении 90:10 по объему
|
|
Этилацетат, хч
|
ГОСТ
22300-76
|
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой
квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Аналитическая колонка, заполненная
сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами С18,
(250×4,6) мм, 5 мкм
|
|
Вакуумный манипулятор для работы с
патронами для твердофазной экстракции
|
|
Воронки делительные вместимостью
250 см3
|
ГОСТ
25336-82
|
Колбы круглодонные на шлифе
вместимостью 10, 25, 100 см3
|
ГОСТ
9737-93
|
Патроны для твердофазной
экстракции, заполненные слабокислым сорбентом на основе силикагеля с
постоянной активностью, 0,4 г
|
ТУ 4215-002-05451931-94
|
Пробирки полипропиленовые
центрифужные с крышками объемом 50 см3
|
|
Ротационный вакуумный испаритель с
мембранным насосом, с пределом вакуума до 10 мбар
|
|
Устройство перемешивающее (50 -
200 колебаний в минуту)
|
ТУ 4389-007-44330709-11
|
Центрифуга со скоростью вращения
4000 об./мин
|
|
Примечание.
Допускается применение оборудования с
аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать
требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ
12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с
электроустановками по ГОСТ
12.1.019-09 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность.
Общие требования и номенклатура видов защиты Система стандартов безопасности
труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и
номенклатура видов защиты Система стандартов безопасности труда.
Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты, а также
требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано
приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной
безопасности по ГОСТ
12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ
12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК
(ОБУВ), установленных ГН
2.2.5.1313-03 и ГН
2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ
12.0.004-90.
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять
специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа,
освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие
получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к
анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности
не более 80 %;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в
условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в
потоке подвижной фазы (1,0 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.2.
Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции
Патрон промывают 3 см3 смеси № 1, затем 3 см3
гексана.
7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ±
0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3,
растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят
при комнатной температуре не более 1 месяца.
7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают
ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10 по
объему, используя мерные цилиндры. Раствор хранят при комнатной температуре не
более 1 месяца.
7.3.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного
гексаном, в делительной воронке интенсивно встряхивают гексан и ацетонитрил
в соотношении 1:5 по объему и после разделения отбирают нижний слой. Используют
непосредственно после приготовления.
7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3:
точную навеску гекситиазокса (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью
100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки
ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с концентрациями гекситиазокса 0,25,
0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/см3 готовят методом последовательного
разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и
0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10).
7.4.2. Раствор № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1,0 см3
основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
7.4.3. Раствор № 2 с концентрацией 2,0 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 4 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.4. Раствор № 3 с концентрацией 1,0 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,5 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,25 мкг/см3:
в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3
раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при
температуре 0 - 4 °С в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в
день приготовления.
При изучении полноты определения гекситиазокса используют
ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом
последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика
- концентрация гекситиазокса в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм3
градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой
концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем
измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади
пика от концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов
рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в
уравнении линейной регрессии:
S - площадь пика
градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента
линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при
замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической
системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного
коэффициента.
Градуировочную зависимость
признают стабильной при выполнении следующего условия:
С - аттестованное значение
массовой концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе,
СK -
результат контрольного измерения массовой концентрации гекситиазокса в
градуировочном растворе,
λконтр. - норматив контроля
градуировочного коэффициента, % (λконтр. = 10 % при Р =
0,95).
В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1
см3 стандартного раствора гекситиазокса с концентрацией 1 мкг/см3.
Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и
переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу
обмывают 1 см3 гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают
патрон 10 см3 гексана и 3 см3 смеси № 2, элюат
отбрасывают. Затем элюируют гекситиазокс смесью № 1 со скоростью 1 - 2 капли в
секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1
см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.
Фракции, содержащие гекситиазокс, объединяют и вновь
анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту
смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.
Примечание. Проверку хроматографического поведения гекситиазокса
следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при
использовании новой партии патронов и растворителей.
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными
правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов
окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от
21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ
10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы
зеленой массы хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Для
длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в
отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение
года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.
Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не
более 2 месяцев.
9.1.
Экстракция гекситиазокса из бобов и масла сои
Навеску измельченных бобов (10 г) или масла (10 г) помещают
в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3,
добавляют 30 см3 ацетонитрила, насыщенного гексаном, пробирку плотно
закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем
центрифугируют (скорость вращения центрифуги - 4000 об./мин.). Ацетонитрил
декантируют в делительную воронку. Экстракцию повторяют 20 см3
ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции дважды, порциями по 10 см3,
промывают гексаном, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при
температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по
п. 9.3.
9.2.
Экстракция гекситиазокса из зеленой массы сои
Навеску измельченной зеленой массы (5 г) помещают в
полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3,
добавляют 40 см3 ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г
хлорида натрия, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее
устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Ацетонитрил декантируют и упаривают
досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С.
Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.
9.3. Очистка
на патроне для твердофазной экстракции
Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 - 9.2, растворяют в
1 см3 гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон
(п. 7.2),
колбу ополаскивают 1 см3 гексана и также наносят на патрон. Патрон
промывают 10 см3 гексана и 3 см3 смеси № 2, элюат
отбрасывают. Гекситиазокс элюируют 5 см3 смеси № 1, элюат собирают,
упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не
выше 40 °С, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 20 мм3
вводят в хроматограф.
9.4.
Условия хроматографирования
Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором,
снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными
полярными группами С18, (250×4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 ± 1)
°С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении
90:10. Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин. Рабочая длина волны
УФ-детектора - 225 нм. Объем вводимой пробы - 20 мм3. Время
удерживания гекситиазокса - (6,1 ± 0,1) мин.
10.
Обработка результатов анализа
Количественное определение
проводят методом абсолютной калибровки. Содержание гекситиазокса в пробе (X,
мг/кг) вычисляют по формуле:
Sx- площадь пика
гекситиазокса на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);
K - градуировочный
коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной
зависимости;
V - объем пробы, подготовленной для
хроматографического анализа, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г.
Содержание остаточных количеств гекситиазокса в образце
вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор
гекситиазокса с концентрацией 5,0 мкг/см3, разбавляют подвижной
фазой для ВЭЖХ.
11.
Проверка приемлемости результатов
параллельных определений
За результат анализа принимают
среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение
между которыми не превышает предела повторяемости (1):
X1, Х2
- результаты параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела
повторяемости (r = 2,8σr).
При невыполнении условия (1)
выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь
выполняют анализ.
Результат анализа представляют в
виде:
( ± Δ) мг/кг при вероятности Р
= 0,95, где
|
- среднее арифметическое результатов
определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной
погрешности, мг/кг;
δ - граница относительной
погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
В случае если содержание компонента меньше нижней границы
диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание
вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05
мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения гексгаиазокса в масле сои).
13.
Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости
измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1
- 6-02
«Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед
проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль
процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд
должна удовлетворять условию:
±Δл,Х (±Δл,Х′)
- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа,
соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению
содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг. При этом:
где Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
δ - граница относительной
погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк
рассчитывают по формуле:
Кк
= ′ - Х - Сд,
где
|
′, Х, Сд
- среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных
приемлемыми по п. 11)
содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация
добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К
рассчитывают по формуле:

|
(1)
|
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк)
с нормативом контроля (К).
Если результат контроля
процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа
признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют.
При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к
неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений,
полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами
измерений, выполненными в двух разных лабораториях, не должно превышать предела
воспроизводимости (R):

|
(3)
|
X1, Х2
- результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с
диапазоном концентраций), %.