4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
гекситиазокса в зеленой массе, бобах и
масле сои методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3324-15

Москва 2016

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств гекситиазокса
в зеленой массе, бобах и масле сои методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.196/01.00043/2015 от 01.06.2015

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств гекситиазокса в диапазонах: в бобах и масле сои 0,05 - 0,5 мг/кг, в зеленой массе 0,1 - 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Гекситиазокс

(4RS,5RS)-5-(4-C]orophenyl)-N-cyclohexyl-4-methyl-2-oxothiazolidine-3-carboxamide (ИЮПАК)

C₁₇H₂₁ClN₂O₂S

Молекулярная масса: 352,6.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 108,0 - 108,5 °С.

Давление пара при 20 °С: 0,0034 мПа.

Растворимость: в воде - 0,5 мг/дм³ (при 20 °С), в хлороформе - 1379, метаноле - 206, ацетоне - 160, ацетонитриле - 28,6, гексане - 4 (г/дм³, при 20 °С).

Стабильность: стабилен к воздействию света, воздуха, нагревания до 300 °С, в кислых и щелочных средах. Для водных растворов на свету DT₅₀ = 16,7 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс и мышей > 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 5000 мг/кг. Ингаляционная токсичность LC₅₀ (4 часа) для крыс - более 2 мг/м³ воздуха. Оказывает раздражающее действие на слизистую глаз, не оказывает - на кожу. Класс опасности по ВОЗ - U. Не токсичен для пчел.

Область применения препарата. Акарицид с овицидной, ларвицидной и нимфацидной активностью в отношении многих видов фитофаговых клещей на плодовых, цитрусовых, овощных культурах, винограде и хлопке.

Гигиенические нормативы для гекситиазокса в России: ВМДУ хлопчатник (семена - 0,5, масло - 0,1 мг/кг), для сои не установлен.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения гекситиазокса, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Метод основан на определении гекситиазокса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов зеленой массы, бобов и масла сои ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация гекситиазокса проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (1,0 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 3 см³ смеси № 1, затем 3 см³ гексана.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10 по объему, используя мерные цилиндры. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке интенсивно встряхивают гексан и ацетонитрил в соотношении 1:5 по объему и после разделения отбирают нижний слой. Используют непосредственно после приготовления.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску гекситиазокса (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями гекситиазокса 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10).

7.4.2. Раствор № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1,0 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3. Раствор № 2 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 4 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.4. Раствор № 3 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,25 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения гекситиазокса используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация гекситиазокса в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе,

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе,

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения гекситиазокса
на патроне для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора гекситиазокса с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см³ гексана и 3 см³ смеси № 2, элюат отбрасывают. Затем элюируют гекситиазокс смесью № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие гекситиазокс, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения гекситиазокса следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы зеленой массы хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция гекситиазокса из бобов и масла сои

Навеску измельченных бобов (10 г) или масла (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 30 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют (скорость вращения центрифуги - 4000 об./мин.). Ацетонитрил декантируют в делительную воронку. Экстракцию повторяют 20 см³ ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции дважды, порциями по 10 см³, промывают гексаном, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.2. Экстракция гекситиазокса из зеленой массы сои

Навеску измельченной зеленой массы (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 40 см³ ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлорида натрия, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Ацетонитрил декантируют и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.3.

9.3. Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный по пп. 9.1 - 9.2, растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ гексана и также наносят на патрон. Патрон промывают 10 см³ гексана и 3 см³ смеси № 2, элюат отбрасывают. Гекситиазокс элюируют 5 см³ смеси № 1, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 20 мм³ вводят в хроматограф.

9.4. Условия хроматографирования

Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами С18, (250×4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 90:10. Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора - 225 нм. Объем вводимой пробы - 20 мм³. Время удерживания гекситиазокса - (6,1 ± 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание гекситиазокса в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x- площадь пика гекситиазокса на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств гекситиазокса в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор гекситиазокса с концентрацией 5,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где * - 0,05 мг/кг - предел обнаружения гексгаиазокса в масле сои).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

±Δ_л,Х (±Δ_л,Х′) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг. При этом:

где Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

′, Х, С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненными в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.