4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ
ДИФЕНОКОНАЗОЛА В КАРТОФЕЛЕ, МОРКОВИ И ТОМАТАХ
МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ

Методические указания

Содержание

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифеноконазола в клубнях картофеля, корнеплодах моркови и плодах томата в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Дифеноконазол - действующее вещество гербицида Скор, КЭ (250 г/л), фирма производитель Сингента Кроп Протекшн АГ (Швейцария).

4-хлорфениловый эфир cis, trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил]фенила (ИЮПАК)

1-[2-[4-(4-хлорфенокси)-2-хлорфенил]-4-метил-1,3-диоксолан-2-илметил]-1Н-1,2,4-триазол (С.А.)

C₁₉H₁₇Cl₂N₃O₃

Мол. масса: 406,3

Кристаллическое вещество от белого до светло-бежевого цвета. Температура плавления: 78,6 °С. Давление паров при 25 °С: 3,3×10^-5 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_OWlogР = 4,20. Растворимость (г/дм³) при 25 °С: этанол - 330, ацетон - 610, толуол - 490, н-гексан - < 3,4, н-октанол - 95, вода - 0,015.

Вещество устойчиво к гидролизу и фотолизу (при естественном солнечном свете DT₅₀ = 145 дней).

Дифеноконазол быстро сорбируется почвой и медленно разрушается.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 1453, для мышей - > 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов - > 2010 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс - > 3300 мг/м³ воздуха. LC₅₀ для рыб 0,8 - 1,2 мг/дм³ (96 час). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей.

Гигиенические регламенты применения дифеноконазола: ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,001 мг/дм³; МДУ в свекле сахарной, яблоках и грушах - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля. ВМДУ в картофеле, моркови и томатах - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Зарегистрирован в России под торговым названием Скор, КЭ (250 г/л) в качестве средства борьбы с возбудителями парши, мучнистой росы и церкоспороза на посадках яблони, груши и посевах сахарной свеклы с нормой расхода препарата 0,15 - 0,4 кг/га. В настоящее время препарат проходит регистрационные испытания в качестве фунгицида на посадках картофеля и томатов, посевах моркови.

1. Метрологические характеристики метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль дифеноконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из растительного материала ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешиваюашхся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дифеноконазол, аналитический стандарт фирмы Сингента (Швейцария) с содержанием д.в. 99,5 %

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификация операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 + 5) °С и относительной влажности не более 80 %.

• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5 %-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO₄ и 2 г K₂СО₃).

7.1.4. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 3 часов.

7.2. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 см³ ацетона и 6 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 см³/мин.

7.3. Проверка хроматографического поведения дифеноконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочного раствора № 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/см³ в смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) (п. 7.5.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 30 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Затем колонку с силикагелем промывают 40 см³ смеси гексан-этилацетат (3:7, по объему). Фракционно (по 5 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5.

7.4. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку НР-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 см³/мин в течение 8 - 10 часов.

7.5. Приготовление градуировочных растворов

7.5.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,010 г дифеноконазола, растворяют в 40 - 50 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.5.2. Раствор дифеноконазола № 1 для градуировки (концентрация 2 мкг/см³).

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2 см³ исходного раствора дифеноконазола с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан-ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов №№ 2 - 5.

Для приготовления проб плодов и корнеплодов с внесением при оценке полноты извлечения дифеноконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор дифеноконазола с концентрацией 1 мкг/см³.

Градуировочный раствор № 1 и ацетоновый раствор дифеноконазола хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы №№ 2 - 5 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,02 - 0,2 мкг/см³).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/см³ (п. 7.5.2), доводят до метки смесью гексан-ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/см³, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ·с) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора (п. 7.5.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79 г.) и правилами, определенными ГОСТами 1725-85 «Томаты свежие», 1721-85 «Морковь столовая, свежая, заготавливаемая и поставляемая. Технические условия», 51808-2001 «Картофель свежий продовольственный, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия», 7176-85 «Картофель свежий, продовольственный, заготовляемый и поставляемый. Технические условия», 26832-86 «Картофель свежий для переработки на продукты питания. Технические условия», 6014-68 «Картофель свежий для переработки. Технические условия».

Пробы клубней картофеля, корнеплодов моркови и плодов томата хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С до анализа.

Перед анализом образцы измельчают ножом или на терке.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция дифеноконазола

9.1.1. Плоды, корнеплоды, клубни. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см³, добавляют 100 см³ ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об/мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см³. Осадок на фильтре промывают 50 см³ ацетона. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/5 объема экстракта (эквивалентна 5 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см³ и добавляют 30 см³ деионизованной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по пп. 9.1.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (10 - 20 см³) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 10 см³ деионизованной воды, 15 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 см³. В воронку вносят 30 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 150 см³. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 см³ смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3 и концентрирующем патроне Диапак-диол по п. 9.4.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,9 см³ этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,1 см³ гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 см³ смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в сек., элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 35 см³ смеси гексан-этилацетат (3:7, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см³. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток экстракта клубней картофеля и плодов томата растворяют в 5 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5. Экстракт корнеплодов моркови дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона Диапак-диол.

9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта корнеплодов моркови в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют при помощи ультразвуковой ванны в 2 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.3). Патрон промывают 2,5 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 9 см³ смеси гексан-ацетон (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 см³. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 см³ смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.5.

9.5. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с электронозахватным детектором с пределом детектирования не выше 8,2×10^-15 г/см³.

Колонка капиллярная кварцевая НР-1 (типа SE-30), длина 5 м, внутренний диаметр 0,53 мм, толщина пленки 0,88 мкм, фирма Хьюлетт-Паккард (США)

Температура термостата испарителя - 270 °С, детектора - 320 °С, термостата колонки - 245 °С

Расход газов: газа-носителя (азот) - 2,5 см³/мин; поддувочного газа через детектор - 25 см³/мин

Деление потока: 1:2

Время удерживания дифеноконазола: 3 мин. 35 сек

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,02 - 0,4 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика дифеноконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 2,0 мкг/см³, разбавляют смесью гексан-ацетон (8:2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание дифеноконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

X - содержание дифеноконазола в пробе, мг/кг;

H₁ - площадь пика образца, мВ·с;

Н_о - площадь пика стандарта, мВ·с;

А - концентрация стандартного раствора дифеноконазола, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемой части образца (г) /для корнеплодов, плодов, клубней - 5 г/.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг (дм³);

r - значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 мг/кг (дм³) при вероятности Р = 0,95,

где  - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг (дм³);

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг (дм³);

∆ = δ·X / 100,

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения»

менее 0,02 мг/кг для корнеплодов, плодов и клубней*.

* - 0,02 мг/кг - предел обнаружения для корнеплодов, плодов и клубней.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

где  - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг (дм³), при этом:

∆_л = ±0,84∆,

где ∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг (дм³);

∆ = δ × X / 100,

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры K_K рассчитывают по формуле:

где  - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг (дм³);

Норматив контроля K рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_K) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг (дм³);

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

14. Разработчики

Дубовая Л.В., науч. сотр.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. наук.

ГНУ ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.