УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 октября 2003 г. Дата введения: 1 декабря 2003 г. |
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма Penicillium
canescens F- 832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1774-03
Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма Penicillium canescens F-832ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ».
Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Микроорганизм Penicilliumcanescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образуетцепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различныхагаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым илисероватым налетом, диаметром 2- 3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колониидостигают 5- 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется,образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колонийоранжево-коричневая.
Штамм устойчив практически ко всем широко известнымантибиотикам.
ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м3,пометка А.
Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительнойвероятности 0,95.
Метод основан на аспирации из воздуха клетокпродуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчетавыросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Косвенный метод измерения концентрацииштамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток наповерхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колонийпо зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результатпродукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.
При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 |
Термостаты электрические суховоздушные или водяные | |
Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами | |
Холодильник бытовой | |
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | |
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 | |
Лупа с увеличением ×10 | ГОСТ 25706-83 |
Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм | |
Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74 |
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 |
Секундомер | ГОСТ 9586-75 |
Барометр | ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556- 81 |
|
5.2 Реактивы, растворы
Антибиотики: группы пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина и др. нистатин или амфотерицин. | |
Спирт этиловый ректификат | ГОСТ 5962-67 |
Среда для штамма-продуцента: агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6, 1 , режим стерилизации 1,1 - 1 ,2 атм в течение 30 мин) | |
Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: КН2РО4 - 1г; MgSО4 7Н2О - 0,5 г; (NH4)2SO4- 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар -18 г; вода дистиллированная- до 1 000 мл Спирт этиловый ректификат | ГОСТ 5962-67 |
|
| |
При выполнении измерений концентрации клетокпродуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующиетребования:
6.1. Правила техники безопасности при работе схимическими реактивами по ГОСТ12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. «Инструкции по устройству, требованиямбезопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораторияхпредприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.
Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С),атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента ксиланазы воздух,аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхностьплотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит отпредполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных поморфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха.Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного изантибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковойфлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петрина горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат насутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильныечашки используют для контроля воздуха.
При выполнении анализа воздуха косвенным методомселективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/лбенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательноперемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальнойповерхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашиванияцеллюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колонийпродуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м' воздуха производят по формуле:
кл/м3 ,где
Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,
1 000 - коэффициент пересчета на 1 м3воздуха,
V - объем воздуха, л (произведение скорости на времяаспирации).
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа
Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе
1. Дата проведения анализа_______________
2. Место отбора пробы__________________
3.Название лаборатории_________________
4.Юридический адрес организации________
Результаты микробиологического анализа
Шифр или № пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл/м3 |
| | |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД52.04.186-96- М., 1991. 693с.
2. ГОСТ 8.563-96.. ГСИ «Методикивыполнения измерений».
3. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
СОДЕРЖАНИЕ