МУК 4.2.1774-03 «Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium canescens F-832 ВКПМ - продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест»

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха.

Обозначение:	МУК 4.2.1774-03
Название рус.:	Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium canescens F-832 ВКПМ - продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест
Статус:	действующий (Введены впервые)
Дата актуализации текста:	01.10.2008
Дата добавления в базу:	01.02.2009
Дата введения в действие:	01.12.2003
Разработан:	Российский государственный медицинский университет
Утвержден:	Главный государственный санитарный врач РФ (24.10.2003)
Опубликован:	Информационно-издательский центр Минздрава России № 2004

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма Penicillium
canescens F- 832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1774-03

1.Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма Penicillium canescens F-832ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ».

Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2.Характеристика штамма-продуцента ксиланазы

Микроорганизм Penicilliumcanescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образуетцепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различныхагаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым илисероватым налетом, диаметром 2- 3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колониидостигают 5- 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется,образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колонийоранжево-коричневая.

Штамм устойчив практически ко всем широко известнымантибиотикам.

ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м³,пометка А.

3.Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительнойвероятности 0,95.

4.Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клетокпродуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчетавыросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Косвенный метод измерения концентрацииштамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток наповерхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колонийпо зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результатпродукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5.Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением ×10	ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм
Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556- 81

5.2 Реактивы, растворы

Антибиотики: группы пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина и др. нистатин или амфотерицин.
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Среда для штамма-продуцента: агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6, 1 , режим стерилизации 1,1 - 1 ,2 атм в течение 30 мин)
Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: КН₂РО₄ - 1г; MgSО₄ 7Н₂О - 0,5 г; (NH4)₂SO₄- 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар -18 г; вода дистиллированная- до 1 000 мл Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клетокпродуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующиетребования:

6.1. Правила техники безопасности при работе схимическими реактивами по ГОСТ12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиямбезопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораторияхпредприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7.Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.

8.Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С),атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9.Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента ксиланазы воздух,аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхностьплотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит отпредполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных поморфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха.Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного изантибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковойфлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петрина горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат насутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильныечашки используют для контроля воздуха.

При выполнении анализа воздуха косвенным методомселективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/лбенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательноперемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальнойповерхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашиванияцеллюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колонийпродуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.