4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма Penicillium
canescens F- 832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1774-03

1.Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма Penicillium canescens F-832ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ».

Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2.Характеристика штамма-продуцента ксиланазы

Микроорганизм Penicilliumcanescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образуетцепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различныхагаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым илисероватым налетом, диаметром 2- 3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колониидостигают 5- 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется,образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колонийоранжево-коричневая.

Штамм устойчив практически ко всем широко известнымантибиотикам.

ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м³,пометка А.

3.Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительнойвероятности 0,95.

4.Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клетокпродуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчетавыросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Косвенный метод измерения концентрацииштамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток наповерхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колонийпо зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результатпродукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5.Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клетокпродуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующиетребования:

6.1. Правила техники безопасности при работе схимическими реактивами по ГОСТ12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиямбезопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораторияхпредприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7.Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.

8.Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С),атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9.Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента ксиланазы воздух,аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхностьплотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит отпредполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных поморфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха.Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного изантибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковойфлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петрина горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат насутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильныечашки используют для контроля воздуха.

При выполнении анализа воздуха косвенным методомселективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/лбенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательноперемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальнойповерхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашиванияцеллюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колонийпродуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10.Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м' воздуха производят по формуле:

кл/м³ ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на времяаспирации).

11.Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа
Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе

1. Дата проведения анализа_______________

2. Место отбора пробы__________________

3.Название лаборатории_________________

4.Юридический адрес организации________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Списоклитературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД52.04.186-96- М., 1991. 693с.

2. ГОСТ 8.563-96.. ГСИ «Методикивыполнения измерений».

3. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

СОДЕРЖАНИЕ