4.2. МЕТОДЫКОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измеренияконцентрации

клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1773-03

1.Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма Candida tropicalis Y-456 -продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполненияизмерений».

Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией«Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды»Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2.Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456 и его гигиеническийнорматив

На сусло-агаре на 2-3 сутки штамм образует круглыекремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колонийсоставляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшоевозвышение - «бугорок», на среде появляется маленькое желто-оранжевоеокрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхностьгладкая, слегка матовая.

Морфологически штамм представлен полиморфнымиклетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2-4 мкм, иногда цепочкиили конгломераты из вытянутых клеток 10-12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.

При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау вчашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями ибластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).

Систематическое положение микроорганизма

Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцентэтанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах сксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5 %содержанием ксилозы: максимальная -80 % ксилита, средняя - 78,8-76,2 % (39,5г/л) ксилита.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованныхсредах. Оптимальная температура роста 35-37 °С, рН среды - 5,0-6,0. Дляразмножения используется сусло-агар 5-6°Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар -20 г, вода - 1 л, рНсреды - 5,0-6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферномвоздухе населенных мест - 30 кл/м³, пометка А.

3.Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительнойвероятности 0,95.

4.Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клетокдрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросшихколоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития.В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри сселективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобныхгрибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9,10).

5.Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штаммапродуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическимиреактивами по ГОСТ12.1.005-88..

6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.005-88.и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиямбезопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораторияхпредприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С),атмосферном давлении 30-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток продуцента воздухаспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхностьсреды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от предполагаемойконцентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний,выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическимпризнакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужаютдо 50-60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашкиПетри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на суткипри температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашкииспользуют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха,  чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. На 2-есутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Принеобходимости культуру подвергают микроскопированию.

Для постановки дополнительного контроля в средудобавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199)из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37°С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С.albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковыетрубки диаметром 3-4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не даютсужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м' воздуха производят по формуле:

кл/м³ ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на времяаспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Candida tropicalisY-456
в атмосферном воздухе населенных мест

1.Дата проведения анализа______________________

2. Место отбора пробы___________________________

3.Название лаборатории__________________________

4.Юридический адрес организации__________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методикивыполнения измерений».

3. Положение об организации работы по техникебезопасности микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности. М., 1977.7 с.

5. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

6. Влодавец В. В., Немыря В. И.Санитарно-микологический контроль объектов окружающей среды на предприятияхмикробиологической промышленности// Гиг. и сан., 1977. № 1. 25-28 с.

7. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: МГУ.122 с.

8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определительпатогенных и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. 110 с.

9. Кашкин П. Н., Лисин В. В. Практическое руководствопо медицинской микологии. М.: Медицина, 1983. 153 с.

10. Kwon-Chung К. J., Bennett J. E. Medical mycology. Philadelphia:Lea & Febiger, 1992. P. 61-62.

СОДЕРЖАНИЕ