УТВЕРЖДАЮ Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации Г. Г. Онищенко 24 октября 2003 г. Дата введения: 1 декабря 2003 г. |
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Bacillus subtilis 103 (Ч-15) - продуцента нейтральной
протеазы в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1771-03
Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма В. subtilis 103 - продуцентанейтральной протеазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполненияизмерений».
Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией«Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды»Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованныхсредах. Оптимальная температура роста 37 °С, оптимальная рН 6,6-7,2,культивирование 18-24 ч. Для размножения используется мясопептоннаяагаризованная среда (МПА) с глюкозой (1 %).
Систематическоеположение микроорганизма
| Класс | Schhomyceles |
| Отряд | Eubacteriales |
| Семейство | Bacillaceae |
| Род | Bacillus |
| Вид | subtilis |
| Штамм | 103 (4-15) |
На среде МПА с глюкозой штамм образует крупныеокруглые колонии, максимальный диаметр которых составляет 1,2-1,3см. Крайколоний слабо волнистый, с мелкими развитыми складками в центральной верхнейчасти. Колонии плоские, матовые, слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей.Не врастают в агар и легко отделяются от него. Цвет от слабо кремового дожелтоватого.
Морфологически штамм представлен подвижными палочками0,8-1,5--2,0 мкм, образующими центрально расположенные эндоспоры 0,6-0,8 мкм,располагаются поодиночке или цепочками различной длины. Палочки снабженыжгутиками, расположенными перитрихиально.
В. subtilis103 аэроб, сапрофит, мезофил, грамположителен. Он интенсивно разлагает белковыесреды благодаря действию протеолитических энзимов, при этом на желатиненаблюдается разжижение, в среде лакмус-молоко - пощелочение, пептонизация.Чувствителен к целому ряду антибиотиков, умеренно чувствителен к ампицилину.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферномвоздухе населенных мест - 5 000 кл/м3.
Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток микроорганизма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительнойвероятности 0,95.
Прямой метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на агаризованную среду МПА с глюкозой (1 %) и подсчетаколичества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на поверхность плотной питательной среды (молочный агар Эйкмана)и подсчета прозрачных зон, образующихся вокруг выросших колоний и четковыделяющихся на общем молоч-но-мутном фоне среды через 18-24 часа.
При данном методе на одной чашке Петри после заборапробы может быть учтено не более 50 колоний, т. к. большее количество колонийна чашке образуют сливающиеся зоны пептонизации молочного белка казеина поддействием нейтральной протеазы.
При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.
| 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
| Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 |
| Термостаты электрические суховоздушные или водяные | |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Бокс, оборудованный бактерицидными лампами | |
| Холодильник бытовой | |
| Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211 | |
| Лупа с увеличением ×10 | ГОСТ 25706-83 |
| Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм | |
| Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74 |
| Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 |
| Секундомер | ГОСТ 9586-75 |
| Барометр | ГОСТ 24696-79 |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556- 81 |
|
| 5.2. Реактивы, растворы
| Антибиотики: ампициллина натриевая соль, нистатин | |
| Спирт этиловый ректификат | ГОСТ 5962-67 |
| Агаризованная среда МПА с глюкозой (глюкоза - 1 %, агар - 1,5-1,8 %, рН 6,6 - 7,2, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин Молочный агар Эйкмана (10 мл среды МПА и 2,5 - 3 мл стерильного молока - содержание жир не более 2 %, белка - 2,8 % - смешать ex temporo) | |
|
При выполнении измерений концентрации клетокштамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическимиреактивами по
ГОСТ12.1.005-88..
6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности» (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.
Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ±5 °С), атмосферномдавлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.
9.1.Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток микроорганизмавоздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью Юл/мин на поверхностьплотной питательной агаризованной среды МПА с глюкозой или на молочный агарЭикмана. Время аспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемойконцентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.
9.2.Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методомагаризованную среду МПА расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотикаампициллина из расчета 10-15 мкг на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры), раствор нистатина из расчета 10 мкг на мл среды (дляподавления грибковой флоры), стерильный раствор глюкозы (1 %), тщательноперемешивают и разливают в чашки Петри.
При выполнении анализа воздуха косвенным методом к ужеприготовленному МПА добавляют, соблюдая все правила асептики, стерильногомолока из расчета 10 мл МПА и 2,5-3,0 мл молока и
разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри нагоризонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на суткипри температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашкииспользуют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 37 оС. Через 18-24 ч производят подсчет выросшихколоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод) или прозрачныхзон вокруг выросших колоний продуцента на общем молочно-мутном фоне среды(косвенный метод) как результат ферментативного действия нейтральной протеазына молочный белок - казеин.
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м' воздуха производят по формуле:
кл/м3 ,где
Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,
1 000 - коэффициент пересчета на 1 м3воздуха,
V - объем воздуха, л (произведение скорости на времяаспирации).
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол №
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Bacillus subtilis103 (Ч-15)
в атмосферном воздухе
1.Дата проведения анализа______________
2. Место отбора пробы__________________
3.Название лаборатории_________________
4.Юридический адрес организации_______
Результаты микробиологического анализа
| Шифр или № пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл/м3 |
| | | |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96.М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методикивыполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасностив микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности. М.,1977.7с.
5. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. - 3с.
СОДЕРЖАНИЕ
