4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Bacillus subtilis 72 - продуцента щелочной протеазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1770-03

1.Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма В. subtilis 72 - продуцентащелочной протеазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазонеконцентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполненияизмерений».

Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных вустановленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией«Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды»Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2.Биологическая характеристика В. subtilis 72 и его гигиенический норматив

Систематическое положение микроорганизма

На МПА штамм образует мелкие ровные круглые колонии, максимальныйдиаметр которых составляет 2,0 мм. Край колоний сильно изрезанный, фестончатый.Колонии гомогенные, гладкие, плоские, матовые. Врастают в агар и трудноотделяются от него. Цвет сероватый на 1-ые сутки и желтоватый на 2-е суткиразвития.

Морфологически штамм представлен подвижными мелкимиудлиненными палочками, образующими центрально расположенные эндоспоры, чащерасполагаются поодиночке или небольшими конгломератами («кучками»). Палочкиснабжены жгутиками, расположенными перитрихиально.

В. subtilis72 аэроб, сапрофит, мезофил, грам-положителен. Штамм интенсивно разлагаетбелковые среды благодаря действию протеолитических энзимов, при этом, нажелатине происходит разжижение, на среде лакмус-молоко - пощелочение,пептонизация.

Чувствителен к целому ряду антибиотиков, устойчив кбензил-пенициллину, карбенициллину, ампицилину, доксициклину, линко-мицину.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованныхсредах. Оптимальная температура роста 40 °С, оптимальная рН 7,2-8,0,культивирование 48 часов. Для размножения используется мясо-пептоннаяагаризованная среда (МПА).

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферномвоздухе населенных мест - 5 000 кл/м³.

3.Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток микроорганизма в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 50 до50 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.Метод измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на агаризованную среду МПА и подсчета количества выросшихколоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на поверхность плотной питательной среды (молочный агар Эйкмана)и подсчета прозрачных зон, образующихся вокруг выросших колоний и четковыделяющихся на общем молочно-мутном фоне среды через 24 часа. При данномметоде на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50колоний, т. к. большее количество колоний на чашке образуют сливающиеся зоныпептонизации молочного белка казеина под действием щелочной протеазы.

5.Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клетокштамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическимиреактивами по ГОСТ12.1.005-88..

6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7.Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующуюподготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8.Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С),атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9.Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизмавоздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин наповерхность плотной питательной агаризованной среды МПА или на молочный агарЭйкмана. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от предполагаемойконцентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенкукрышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методомагаризованную среду МПА расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотикаампициллина из расчета 10-15 мкг на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры), раствор нистатина из расчета 10 мкг на мл среды (дляподавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

При выполнении анализа воздуха косвенным методом к ужеприготовленному МПА добавляют, соблюдая все правила асептики, стерильногомолока из расчета 10 мл МПА и 2,5-3,0 мл молока и разливают по 10 мл встеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на суткипри температуре 37 ^оС, после чего проросшие чашки бракуют,стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 40 °С. Через 24-48 ч производят подсчет выросших колоний покультурально-морфологическим признакам (прямой метод) или прозрачных зон вокругвыросших колоний продуцента на общем молочно-мутном фоне среды (косвенныйметод), как результат ферментативного действия щелочной протеазы на молочныйбелок - казеин.

10.Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м' воздуха производят по формуле:

кл/м³ ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м³воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на времяаспирации).

11.Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Bacillus subtilis 72
 в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа______________

2. Место отбора пробы__________________

3.Название лаборатории_________________

4.Юридический адрес организации_______

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Списоклитературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96.М.,1991. 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методикивыполнения измерений».

3. Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

4. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». - М.: Изд-во стандартов, 1981. 3с.

СОДЕРЖАНИЕ