На главную
На главную

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus subtilis 65 - продуцента нейтральной протеиназы и амилазы в атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма В. subtilis 65 - продуцента нейтральной протеиназы и амилазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.

Обозначение: МУК 4.2.1769-03
Название рус.: Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Bacillus subtilis 65 - продуцента нейтральной протеиназы и амилазы в атмосферном воздухе населенных мест
Статус: действует
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.02.2017
Дата введения в действие: 01.12.2003
Утвержден: 24.10.2003 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Ссылки для скачивания:

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измеренияконцентрации
клеток микроорганизма Bacillus subtilis 65 – продуцента

нейтральнойпротеиназы и амилазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1769-03.

1.Общиеположения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методикупроведения микробиологического количественного анализа концентрации клетокштамма В. subtilis 65 - продуцентанейтральной протеиназы и амилазы в атмосферном воздухе населенных мест вдиапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии стребованиями ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполненияизмерений».

Методические указания предназначены для применения влабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленномпорядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией«Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды»Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2.Биологическая характеристика В. subtilis 65
и его гигиенический норматив

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованныхсредах. Оптимальная температура роста 37 °С, оптимальная рН 6,6-7,2, культивирование18-24 часа. Для размножения используется мясопептонная агаризованная среда(МПА) с глюкозой (1 %).

Систематическое положение микроорганизма

Класс

Schizomycetes

Отряд

Eubacteriales

Семейство

Bacillaceae

Род

Bacillus

Вид

subtilis

Штамм

65

На МПА штамм образует небольшие округлые колонии,максимальный диаметр которых составляет 0,5-0,7 см. Край колоний изрезанный, схарактерным белым налетом в центральной верхней части. Колонии гладкие, плоские,матовые, сухие. Не врастают в агар и легко отделяются от него. Цвет от слабокремового до желтоватого.

Морфологически штамм представлен подвижными мелкимипалочками, образующими центрально расположенные эндоспоры, располагаются поодиночкеили цепочками различной длины. Палочки снабжены жгутиками, расположеннымиперитрихиально.

В. subtilis65 строгий аэроб, сапрофит, мезофил, грамположителен. Штамм интенсивноразлагает белковые среды благодаря действию протеолитических энзимов, при этом,на желатине происходит разжижение, на среде лакмус-молоко - пощелочение,пептонизация. Чувствителен к целому ряду антибиотиков, устойчив к ампицилину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферномвоздухе рабочей зоны - 4 000 кл/м3, пометка А.

3.Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количестваклеток микроорганизма в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 50 до50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4.Метод измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на агаризованную среду МПА с глюкозой (1 %) и подсчетаколичества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клетокмикроорганизма на поверхность плотной питательной среды (молочный агар Эйкмана)и подсчета прозрачных зон, образующихся вокруг выросших колоний и четковыделяющихся на общем молочно-мутном фоне среды через 18-24 часа.

При данном методе на одной чашке Петри после забора пробыможет быть учтено не более 50 колоний т. к. большее количество колоний на чашкеобразуют сливающиеся зоны пептонизации молочного белка казеина.

5.Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средстваизмерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова)

ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

 

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

 

Холодильник бытовой

 

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

 

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

 

Лупа с увеличением ×10

ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм

 

Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл

Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл

Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл

ГОСТ 10515-75

ГОСТ 10515-75

ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл

ГОСТ 1770-74

Секундомер

ГОСТ 9586-75

Барометр

ГОСТ 24696-79

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556- 81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: ампициллина натриевая соль, нистатин

 

Спирт этиловый ректификат

ГОСТ 5962-67

 Агаризованная среда МПА с глюкозой (глюкоза - 1 %, агар - 1,5-1,8 %, рН 6,6 - 7,2, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин Молочный агар Эйкмана (10 мл среды МПА и 2,5 - 3 мл стерильного молока - содержание жир не более 2 %, белка - 2,8 % - смешать ex temporo)

 

6.Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клетокштамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе схимическими реактивами по  ГОСТ12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе сэлектроустановками по ГОСТ12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиямбезопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораторияхпредприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только ввытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материаломосуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7.Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатовдопускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедшихсоответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологическихисследований.

8.Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб канализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С),атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9.Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизмавоздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин наповерхность плотной питательной среды МПА или молочный агар Эйкмана. Времяаспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клетокштамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздухатщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхностьподвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки.На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой,одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышкиприбора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска,прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от даннойчашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирациии дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методомагаризо-ванную среду МПА расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляютсвежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотикаампициллина из расчета 10-15 мкг на 1 мл среды (для подавления постороннейбактериальной микрофлоры), раствор нистатина из расчета 10 мкг на 1 мл среды(для подавления грибковой флоры), стерильный раствор глюкозы (1 %), тщательноперемешивают и разливают в чашки Петри.

При выполнении анализа воздуха косвенным методом к ужеприготовленному МПА добавляют, соблюдая все правила асептики, стерильного молокаиз расчета 10 мл МПА и 2,5-3,0 мл молока и разливают по 10 мл в стеклянныечашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на суткипри температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашкииспользуют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают втермостат на 37 °С. Через 18-24 часов производят подсчет выросших колоний покультурально-морфологическим признакам (прямой метод) или прозрачных зон вокругвыросших колоний продуцента на общем молочно-мутном фоне среды (косвенныйметод), как результат ферментативного действия нейтральной протеиназы намолочный белок - казеин.

10.Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1м3 воздуха производят по формуле:

кл/м3 ,где

Х- концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м3воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11.Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
штамма-продуцента Bacillus subtilis 65
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа______________

2. Место отбора пробы__________________

3.Название лаборатории_________________

4.Юридический адрес организации_______

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы

Определяемый микроорганизм

Концентрация, кл/м3

 

 

 

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Списоклитературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. «Методикивыполнения измерений».

3. Положение об организации работы по техникебезопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасностии личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятиймикробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. ГОСТ17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методамопределения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. - 3 с.

СОДЕРЖАНИЕ

1.Общие положения и область применения. 1

2. Биологическая характеристика В. subtilis 65  и его гигиенический норматив. 1

3. Пределы измерений. 1

4. Метод измерений. 2

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,  реактивы и материалы.. 2

6. Требования безопасности. 2

7. Требования к квалификации операторов. 2

8. Условия измерений. 2

9. Проведение измерения. 2

10. Вычисление результатов измерения. 3

11. Оформление результатов измерений. 3

Результаты измерений оформляют протоколом по форме. 3

Список литературы.. 3

 

166
Мне нравится
Комментировать Добавить в закладки

Комментарии могут оставлять только зарегистрированные пользователи.

Пожалуйста зарегистрируйтесь или авторизуйтесь на сайте.