4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определениеостаточных количеств дифлубензурона
в воде хроматографическими методами

Методические указания
МУК 4.1.2349-08

1.Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина, Н.Е.Федорова, В.Н. Волкова, С.И. Волчек).

2.Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическомунормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителейи благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. № 3).

3.Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачомРоссийской Федерации Г.Г. Онищенко 29 февраля 2008 г.

4.Введены в действие с 18 мая 2008 г.

5. Введенывпервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральнойслужбы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г. Онищенко

29февраля 2008 г.

Датавведения: 18 мая 2008 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств дифлубензурона
в воде хроматографическими методами

Настоящиеметодические указания устанавливают методы высокоэффективной жидкостной игазожидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрациидифлубензурона в диапазоне 0,0025-0,025 мг/дм³.

1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина(IUPAC)

C₁₄H₉ClF₂N₂О₂                                                                                                                     Мол.масса 310.7

Белоекристаллическое вещество. Температура плавления 228°С. Давление паров при 25°С:1,2·10^-4 мПа. Коэффициент распределения н-октанол-вода K_owlogP-3,89. Плотность - 1.56. Растворимость в воде (рН 7,25°С) - 0,08 мг/дм³.Растворимость в органических растворителях (в г/дм³, при 20°С):гексан - 0,063, толуол - 0,29, дихлорметан - 1,8, метанол 1,1.

Водные растворыстабильны в диапазоне рН от 5до 7 (LD₅₀ более 150 дней), при рН 9 LD₅o - 42дня. Растворы чувствительны к солнечному свету.

Краткая токсикологическая характеристика:

Остраяпероральная токсичность (LD₅₀) для крыс и мышей - более4600 мг/кг, острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 10000мг/кг, острая ингаляционная токсичность для крыс (LK₅₀) - более 35 мг/дм³.

Область применения

Дифлубензурониспользуется в качестве инсектицида гормонального действия, нарушающего процессобразования хитина в организме насекомых. Активен против большого числанасекомых, обладает, в основном, кишечным действием. Рекомендуется для борьбы сболезными плодовых культур (яблоня), овощных (капуста), в лесопосадках длязащиты грибов, борьбы с личинками комаров.

ПДКдифлубензурона в воде водоемов - 0,005 мг/дм³.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условийпроведения анализа в точном соответствий с данной методикой погрешность (и еёсоставляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазоновконцентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнотаизвлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднегорезультата для полного диапазона концентраций (n=20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечениявещества, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана наопределении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) и газожидкостной хроматографии (ГЖХ)с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР) после экстракции изанализируемой пробы воды гексаном и последующей очистки экстрактаперераспределением в системе несмешивающихся растворителей. Длягазохроматографического измерения дифлубензурон подвергают кислотному гидролизус последующей обработкой трифторуксусным ангидридом.

3. Средства измерений, вспомогательныеустройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Допускаетсяиспользование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Допускается использованиереактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3.Вспомогательные устройства, материалы

Допускается применение хроматографических колонок идругого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасностипри работе с химическими реактивами по ГОСТ12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками поГОСТ12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации нажидкостный и газовый хроматографы.

4.2.Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм,установленных ГН2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ ввоздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004 .

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измеренийдопускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, сопытом работы на жидкостном и газовом хроматографах.

К проведениюпробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опытработы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполненииизмерений соблюдают следующие условия:

-процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят притемпературе воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

-выполнение измерений на хроматографах проводят в условиях, рекомендованныхтехнической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнениюизмерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей(при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционированиехроматографической колонки, приготовление растворов, градуировочных растворов ирастворов внесения, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

7.1. Подготовка органическихрастворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрилкипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, послечего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторноперегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка н-гексана

Растворительпоследовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до техпор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральнойреакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Приготовление 12.5 N растворагидроксида натрия

Навескугидроксида натрия массой 50 г помещаютв мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят водой до метки,тщательно перемешивают.

7.3. Приготовлениерастворов солянойкислоты

Дляприготовления 3.6М и 1М растворов в мерные колбы вместимостью 100 см³,содержащие 30-40 см³ дистиллированной воды, помещают соответственно30 см³ или 8 см³ соляной кислоты, доводятдистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

7.4. Подготовка подвижной фазы дляВЭЖХ

В мерную колбувместимостью 1000 см³ помещают 550 см³ ацетонитрила и 450см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают,фильтруют и дегазируют.

7.5. Кондиционирование хроматографическойколонки для ВЭЖХ

Промываютколонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачирастворителя 0,3 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.6. Подготовка и кондиционированиехроматографической колонки для ГЖХ

Готовую насадку(Супелкопорт с 5% OV-210) засыпают в стеклянную колонку длиной 1 м,уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, неподсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 260°С втечение 10--12 ч.

7.7. Приготовление градуировочныхрастворов и растворов внесения

7.7.1. Серия № 1 (метод ВЭЖХ)

7.7.1.1.Исходный раствор дифлубензурона дляградуировки (концентрация 1 мг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,100 гдифлубензурона, добавляют 50-70 см³ ацетонитрила, перемешивают,доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится вхолодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы № 1-5готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного растворадля градуировки.

7.7.1.2. Раствор№ 1 дифлубензурона для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³).

В мерную колбувместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного растворадифлубензурона с концентрацией 1 мг/см³ (п.7.7.1.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранитсяв холодильнике в течение месяца.

Раствориспользуют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечениядействующего вещества методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатовизмерений методом добавок.

7.7.1.3. Рабочиерастворы № 2-5 дифлубензурона для градуировки (концентрация 0,1-1,0 мкг/см³).

В 4 мерныеколбы вместимостью 100 см³ помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 см³градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.7.1.2.), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной поп. 7.4.,тщательно перемешивают, получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрациейдифлубензурона 0,1, 0,2, 0.5 и 1,0 мкг/см³, соответственно.

Растворыхранятся в холодильнике в течение недели.

7.7.2. Серия № 2 (метод ГЖХ)

7.7.2.1. Исходный раствордифлубензурона для градуировки (концентрация 200 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью100 см³ вносят 0,0200 г дифлубензурона, добавляют 50-70 см³метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Растворхранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

7.7.2.2.Раствор № 1 производного дифлубензурона для градуировки (соответствуетконцентрации дифлубензурона 20 мкг/см³)

В круглодоннуюколбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходногораствора дифлубензурона с концентрацией 200 мкг/см³ (п.7.7.2.1), растворитель отдувают потоком теплого воздуха и проводят гидролизи дериватизацию согласно п.п. 9.2 и 9.3 соответственно. Раствор полученного производногоупаривают до 5-7 см³, переносят в мерную пробирку и добавляют бензолдо объема 10 см³. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 2-5готовят объемным методом путем последовательного разбавления раствора № 1производного дифлубензурона для градуировки.

7.7.2.3.Рабочие растворы № 2-5 производного дифлубензурона для градуировки(соответствуют концентрации дифлубензурона 0,1-1,0 мкг/см³).

В 4 мерныеколбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 см³градуировочного раствора № 1 с концентрацией 20 мкг/см³ (п.7.7.2.2), доводят до метки бензолом, тщательно перемешивают, получаютрабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией дифлубензурона 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0мкг/см , соответственно.

Растворыхранятся в холодильнике в течение недели.

7.8. Установление градуировочнойхарактеристики

7.8.1. Метод ВЭЖХ

Градуировочную характеристику,выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика (отн.единицы) от концентрации дифлубензурона в растворе (мкг/см³),устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки №№2-5.

В инжекторхроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора ианализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.1. Осуществляют не менее 3-х параллельныхизмерений. Устанавливают площади пиков дифлубензурона.

7.8.2. Метод ГЖХ

Градуировочнуюхарактеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимостьвысоты пика (мм) от концентрации дифлубензурона в растворе (мкг/см³),устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам производногодифлубензурона для градуировки №№ 2-5.

В испарительхроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора ианализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.2. Осуществляют не менее 3-х параллельныхизмерений. Устанавливают высоты пиков производного дифлубензурона.

8. Отбор проб

Отбор пробпроизводится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общиетребования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора пробсельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей средыдля определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы водыанализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре4-6°С в течение 10-ти дней. Для длительного хранения пробы замораживают ихранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С.

Перед анализомобразцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образецанализируемой воды объемом 200 см³ помещают в стакан вместимостью400 см³, добавляют 5-7 см³ 1М соляной кислоты до рН неболее 2 (контроль по индикаторной бумаге). Подкисленный раствор переносят вделительную воронку вместимостью 500 см³, приливают 50 см³гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фазверхний органический слой переносят в коническую колбу вместимостью 250 см³.Водную фазу возвращают в делительную воронку, операцию экстракции повторяют ещедважды порциями гексана по 50 см³. Объединенный гексановый экстрактпомещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, приливают 50 см³ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделенияфаз нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250см³, фильтруя его через слой (2 см) безводного сульфата натрия,помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажнымфильтром «красная лента». Операцию экстракции гексанового раствора повторяют ещедважды порциями ацетонитрила по 50 см³. Отстоявшийся слой хлористогометилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенныйэкстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше40°С почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха.

Сухой остатокпри проведении измерений методом ВЭЖХ (по п.9.4.1) растворяют в 5 см³ подвижной фазы, центрифугируют(фильтруют через слой стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку) ианализируют содержание дифлубензурона в соответствии с п. 9.4.1.

При проведении измерений методом ГЖХ (по п. 9.4.2) сухой остаток подвергают гидролизуи дериватизации в соответствии с п.п.9.2 и 9.3.

9.2. Гидролиз дифлубензурона

В колбу с сухимостатком, полученным по п. 9.1(или при упаривании исходного раствора дифлубензурона по п.7.7.2.2),вносят 60 см³ 3,6М раствора соляной кислоты, подсоединяют обратныйхолодильник, выдерживают колбу в течение 6-ти часов на кипящей водяной бане.После охлаждения к реакционной массе добавляют 12.5 № раствор гидроксида натриядо рН10 (контроль по индикаторной бумаге), переносят в делительную воронкувместимостью 250 см³, вносят в воронку 50 см³ бензола,интенсивно встряхивают 1 мин. После полного разделения фаз верхний органическийслой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 см³, фильтруяего через слой (2 см) безводного сульфата натрия, помещенный в конуснуюхимическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «краснаялента». Операцию экстракции водного раствора повторяют еще дважды порциямибензола по 50 см³. Отстоявшийся слой бензола (верхний слой)фильтруют через сульфат натрия в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенныйэкстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40°С дообъема 20-30 см³ и подвергают дериватизации по п. 9.3.

9.3. Дериватизация

В колбу сбензольным раствором, полученным по п.9.2, вносят0,5 см³ ангидрида трифторуксусной кислоты, подсоединяют обратный холодильник,выдерживают колбу на водяной бане при температуре 50°С в течение 3-х часов.После охлаждения раствор упаривают до 3-4 см³, переносят вградуированную пробирку вместимостью 5 см³, доводят бензолом дообъема 5 см³ и анализируют содержание дифлубензурона в соответствиис п. 9.4.2

9.4. Условия хроматографирования

9.4.1. Метод ВЭЖХ

Жидкостнойхроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США)

Колонка стальнаядлиной 25 см, внутренним диаметром 2 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2,зернением 5 мкм.

Температураколонки: комнатная.

Подвижная фаза:ацетонитрил-вода (55:45, по объему).

Скорость потокаэлюента: 0,3 см³/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм.

Чувствительность:0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимойпробы: 20 мм³.

Ориентировочноевремя выхода дифлубензурона: 7,36-7,78 мин.

Линейныйдиапазон детектирования 2-20 нг.

Образцы, дающиепики, большие, чем градуировочный раствор дифлубензурона с концентрацией 1мкг/см³, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ(подготовленной по п. 7.4.).

9.4.2. Метод ГЖХ

Хроматографгазовый «Цвет 560-02» с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов.

Колонкастеклянная длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненная Супелкопортом(0,16-0,12 мм) с 15% OV-210

Температуратермостата колонки - 130°С

детектора - 300°С

испарителя - 150°С

Скоростьгаза-носителя (азот) - 25±1 см³/мин.

Рабочая шкалаэлектрометра - 64·10¹⁰ ом.

Объем вводимойпробы - 1 мм³.

Ориентировочноевремя удерживания производного дифлубензурона 2 мин 35 с.

Линейныйдиапазон детектирования: 0,1-1,0 нг.

Образцы, дающиепики, большие, чем градуировочный раствор производного дифлубензурона сконцентрацией 1 мкг/см³, разбавляют (не более чем в 50 раз)бензолом.

10. Обработка результатов анализа

Содержаниедифлубензурона в пробе рассчитывают по формуле:

где Х - содержаниедифлубензурона в пробе, мг/дм³;

А - концентрациядифлубензурона, найденная по градуировочному графику, в соответствии свеличиной площадей (высоты) хроматографического пика, мкг/см³;

W -объем экстракта,подготовленного для хроматографирования, см³;

V -объеманализируемого образца воды, см³.

11. Проверка приемлемости результатовпараллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельныхопределений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

 где                                     (1)

X₁, X₂ - результаты параллельныхопределений, мг/дм³;

r- значениепредела повторяемости (табл. 1), при этом r=2,8σ_r.

Приневыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости,устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результатанализа представляют в виде:

мг/дм³при вероятности Р=0,95, где

 -среднееарифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³;

Δ -граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

,

δ - границаотносительной погрешности методики (показатель точности в соответствии сдиапазоном концентраций, табл.1), %.

В случае еслисодержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций,результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,0025 мг/дм³»*

___________________

* - 0,0025 мг/дм³- предел обнаружения

13. Контроль качества результатовизмерений

Оперативныйконтроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется всоответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность ипрецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1.Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений,анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализапроводится методом добавок.

Величинадобавки С_д должна удовлетворять условию:

 где

 - характеристика погрешности (абсолютнаяпогрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента виспытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце сдобавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

Δ_л=±0,84D, где

Δ - границаабсолютной погрешности, мг/дм³;

,

δ - граница относительнойпогрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазономконцентраций, табл. 1), %.

Результат контроляпроцедуры К_к рассчитывают по формуле:

 ,где

 - среднее арифметическоерезультатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п.11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце,концентрация добавки, соответственно, мг/дм³;

Нормативконтроля К рассчитывают по формуле

Проводятсопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативомконтроля (К).

Если результатконтроля процедуры удовлетворяет условию

|K_k|£K,                                                                               (2)

процедуруанализа признают удовлетворительной.

Приневыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторномневыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительнымрезультатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверкаприемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождениемежду результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должнопревышать предела воспроизводимости (R)

,где                                                     (3)

Х₁, Х₂ - результаты измерений вдвух разных лабораториях, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.