Государственное санитарно-эпидемиологическоенормирование Российской Федерации
Федеральная служба по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
изопропилфенацина в воде
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК4.1.2292-07
1.Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина,Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).
2.Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическомунормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителейи благополучия человека (протокол от 21.06.2007 № 2).
3.Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачомРоссийской Федерации Г.Г. Онищенко 10 октября 2007 г.
4.Введены в действие с 25 декабря 2007 г.
5.Введены впервые.
Содержание
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
10 октября 2007 г.
Дата введения: 25 декабря 2007 г.
4.1.МЕТОДЫКОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определениеостаточных количеств изопропилфенацина в воде
методомвысокоэффективной жидкостной хроматографии
Методическиеуказания
МУК 4.1.2292-07
Настоящиеметодические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостнойхроматографии для определения в воде массовой концентрации изопропилфенацина вдиапазоне 0,0002-0,004 мг/дм3.
2-(α-фенил-изопропилфенил)-ацетил)-индан-1,3-дион(IUРАС)
С3Н7
С26Н22О3
Мол. масса 382,15
Твердое веществожелто-оранжевого цвета. Температура плавления 148°С, кипения - более 350°С.Плотность 1,21 г/см3. Хорошо растворим в большинстве органическихрастворителей (ацетоне, этаноле, диэтиловом эфире и др.). Практически нерастворим в воде - 0,3 мг/дм3.
Агрегатноесостояние в воздушной среде - аэрозоль и пары.
Остраяпероральная токсичность (LD50) для крыс - более 1,6±0,2 мг/кг,мышей - 3,4±0,5 мг/кг.
Областьприменения
Изопропилфенацин- ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью,рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) назимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковыенасаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона.Применяется в виде приманки.
ОДУизопропилфенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/дм3.
Присоблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точномсоответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измеренийпри доверительной вероятности Р = 0,95не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующихдиапазонов концентраций.
Таблица 1
Метрологические параметры
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (дм3) | Показатель точности (граница относительной погрешности) ±δ, %Р=0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, σr % | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | от 0,004 до 0,001 вкл. | 100 | 4,2 | 12 | 15 |
| менее 0,001 до 0,0002 | 150 | 5,4 | 15 | 19 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n=20) приведены в табл. 2.
Таблица 2
Полнота извлечения вещества, стандартноеотклонение, доверительный интервал среднего результата
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р=0,95, n=20 |
| предел обнаружения, мг/дм3 | диапазон определяемых концентраций, мг/дм3 | среднее значение определения, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, ±, % |
| Вода | 0,0002 | 0,0002-0,004 | 91,3 | 3,8 | 2,7 |
Методикаоснована на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции изанализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта напатроне для твердофазной экстракции Sep Pak Silica.
| Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Waters, США) 15311-02 | Номер в Государственном реестре средств измерений |
| Весы аналитические ВЛА-200 | ГОСТ 24104 |
| Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Меры массы | ГОСТ 7328 |
| Пипетки градуированные 2 класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 см5 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные 2 класса точности вместимостью 10, 50, 100 и 1000 см3 | ГОСТ 1770 |
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшимихарактеристиками.
| Изопропилфенацин, аналитический стандарт с содержанием основного вещества (сумма изомеров) 94,6% (ЗАО «Щелково Агрохим») | |
| Ацетонитрил для хроматографии, хч | ТУ 6-09-4326-76 |
| Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМnО4 | ГОСТ 6709 |
| н-Гексан, хч | ТУ 6-09-33-75 |
| Натрий серно-кислый безводный, хч | ГОСТ 4166 |
| Кислота орто-фосфорная, хч, 85% | ГОСТ 6552 |
| Метилен хлористый (дихлорметан), хч | ГОСТ 12794 |
| Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) эталонный | ГОСТ 4166 |
Допускается использованиереактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
| Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами) | |
| Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария) | |
| Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные | ТУ 6-09-2678-77 |
| Воронки делительные вместимостью 1000 см3 | ГОСТ 25336 |
| Воронки конусные диаметром 30-37 и 60 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | |
| Колбы плоскодонные вместимостью 200-250 см3 | ГОСТ 9737 |
| Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 10, 100 и 250 см3 | ГОСТ 9737 |
| Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм | |
| Насос водоструйный | ГОСТ 10696 |
| Патроны для твердофазной экстракции типа Sep-Pak Plus Silica Cartridges (масса сорбента 690 г) | |
| Пробирки центрифужные | ГОСТ 25336 |
| Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария | ТУ 25-11-917-74 |
| Стаканы химические, вместимостью 50 и 100 см3 | ГОСТ 25336 |
| Стекловата | |
| Стеклянные палочки | |
| Установка для перегонки растворителей через мембрану | |
| Хроматографическая колонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry® С18, зернением 5 мкм | |
| Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50-100 мм3 | |
| Шприц медицинский с разъемом Льюера | ГОСТ 22090 |
Допускается применение хроматографических колонок и другогооборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1.При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасностипри работе с химическими реактивами по ГОСТ12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками поГОСТ12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации нажидкостный хроматограф.
4.2.Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм,установленных ГН2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ ввоздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ12.0.004.
Квыполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не нижелаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведениюпробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опытработы в химической лаборатории.
При выполненииизмерений соблюдают следующие условия:
-процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят притемпературе воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.
-выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях,рекомендованных технической документацией к прибору.
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органическихрастворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ,кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов дляградуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовкапатронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведениявещества на них, отбор проб.
7.1.1. Очистка ацетонитрила
Ацетонитрилкипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, послечего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторноперегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.2. Очистка этилацетата
Этилацетатпромывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщеннымраствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняютили подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретическихтарелок не менее 50.
7.1.3.Очистка н-гексана
Растворительпоследовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до техпор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральнойреакции промывных вод, перегоняют над поташом.
В мерную колбувместимостью 1000 см3 помещают 890 см3 ацетонитрила, 110см3 бидистиллированной или деионизованной воды и 1 см3 ортофосфорнойкислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
Промываютколонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачирастворителя 1,0 см3/мин до установления стабильной базовой линии.
7.4.1. Исходный раствор изопропилфенацина для градуировки (концентрация100 мкг/см3)
В мерную колбувместимостью 100 см3 вносят 0,01 г изопропилфенацина, добавляют50-70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом дометки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
Растворы № 1-5 готовятобъемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
7.4.2. Раствор № 1 изопропилфенацина для градуировки и внесения(концентрация 10 мкг/см3)
В мерную колбувместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствораизопропилфенацина с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.4.1), разбавляютацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течениемесяца.
Этот раствориспользуют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечениядействующего вещества методом «внесено-найдено».
7.4.3. Рабочие растворы № 2-5 изопропилфенацина для градуировки(концентрация 0,05-1,0 мкг/см3)
В 4 мерныеколбы вместимостью 100 см3 помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 см3градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 7.4.2),доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают,получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией изопропилфенацина 0,05; 0,1;0,5 и 1,0 мкг/см3, соответственно.
Растворыхранятся в холодильнике в течение недели.
Градуировочнуюхарактеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость суммыплощадей 2 пиков орто- и параизомеров изопропилфенацина (мкВ·с) от концентрациивещества в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютнойкалибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.
В инжекторхроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора ианализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 3параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующеговещества, рассчитывают сумму площадей орто- и параизомеров изопропилфенацина.
Градуировочныйграфик проверяют ежедневно по анализу 2 растворов для градуировки различнойконцентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных,заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используясвежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
В мерную колбувместимостью 100 см3 помещают 50-70 см3 этилацетата,вносят 2 см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательноперемешивают.
Патрон Sep-Pak Plus Silica устанавливают на аллонж спрямым отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюераобъемом не менее 10 см3, используемый в качестве емкости дляэлюента.
Концентрирующийпатрон промывают последовательно 5 см3 этилацетата, затем 5 см3смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованиемвакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин,при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
Примечание: В отсутствии специальногоаллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скоростьпродавливания раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.
В круглодоннуюколбу вместимостью 10 см3 помещают 0,2 см3 градуировочногораствора №1 изопропилфенацина (п. 7.4.2),растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток растворяютв 2 см3 этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем вколбу добавляют 2 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и вносятна концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбуобмывают 5 см3 смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносятна патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см3 смесигексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см3 смеси этих жерастворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см3 этилацетата.Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек.Элюат отбрасывают.
Изопропилфенацинэлюируют с патрона 25 см3 2% уксусной кислоты в этилацетате (п.7.6), собирая 5 порций элюата по 5 см3 каждая непосредственно вкруглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше35°С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 см3 подвижной фазы(приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержаниеизопропилфенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие изопропилфенацин, объединяют ивновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полнотусмывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Проверкухроматографического поведения изопропилфенацина следует проводить обязательно,поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партиипатронов и растворителей.
Отбор пробпроизводится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общиетребования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора пробсельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей средыдля определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).
Пробы водыанализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике притемпературе 4-6°С в течение 10недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовойтаре в морозильной камере при температуре -18°С.
Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.
Образецанализируемой воды объемом 500 см3 помещают в делительную воронку,вместимостью 1000 см3, добавляют 75 см3 хлористого метилена,интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полногоразделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу,вместимостью 250 см3, фильтруя его через 2 см слой безводногосульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм,снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазыповторяют, еще дважды порциями этилацетата по 50 см3. Отстоявшийсяслой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученнымэкстрактом.
Объединенныйэкстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.
Сухой остаток вколбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 см3 этилацетата, помещаютна 30с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см3 гексана,смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Plus Silica, подготовленный по п.7.7. Колбу обмывают 5 см3 смесигексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрондополнительно промывают 15 см3 смеси гексан-этилацетат (1:1, пообъему), 20 см3 смеси этих же растворителей в объемном соотношении3:7, затем 20 см3 этилацетата. Скорость прохождения раствора черезпатрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.
Изопропилфенацинэлюируют с патрона 20 см3 2% уксусной кислоты в этилацетате (п.7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упариваютдосуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 2 см3подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержаниеизопропилфенацина по п. 9.3.
Измерениявыполняют при следующих режимных параметрах.
Жидкостнойхроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters,США).
Хроматографическаяколонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry®С18, зернением 5 мкм.
Температураколонки: комнатная.
Подвижная фаза:ацетонитрил-вода-орто-фосфорная кислота (89:11:0,1, по объему).
Скорость потокаэлюента: 1,0 см3/мин.
Рабочая длинаволны: 312 нм.
Чувствительность:0,005 ед. абсорбции на шкалу.
Объем вводимойпробы: 20 мм3.
Ориентировочноевремя выхода изопропилфенацина:
- орто-изомер:7,72-8,01 мин
- пара-изомер:9,14-9,45 мин.
Линейныйдиапазон детектирования: 1-20 нг.
Образцы, дающиепики, большие, чем градуировочный раствор изопропилфенацина с концентрацией 1 мкг/см3,разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).
Содержание изопропилфенацинав пробе рассчитывают по формуле:
где Х- содержаниеизопропилфенацина в пробе, мг/дм3;
A -концентрация изопропилфенацина, найденная по градуировочному графику, всоответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков орто- ипараизомеров, мкг/см3;
W - объемэкстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
V - объем анализируемого образца воды, см3.
За результат анализапринимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений,расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
(1)
где X1, X2 - результаты параллельныхопределений, мг/дм3;
r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r=2,8 σr.При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости,устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результатанализа представляют в виде:
мг/дм3 при вероятности Р=0,95, где
- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми,мг/дм3;
Δ -граница абсолютной погрешности, мг/дм3;
где δ- граница относительной погрешности методики (показатель точности всоответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае еслисодержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций,результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/дм3»*
__________________
*0,0002 мг/дм3- предел обнаружения.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измеренийосуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность(правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».
13.1.Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений,анализируя один из градуировочных растворов.
13.2.Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализапроводится методом добавок.
Величинадобавки Сд должна удовлетворять условию:
где 
- характеристика погрешности(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержаниюкомпонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента вобразце с добавкой соответственно) мг/дм3, при этом:
Dл = ± 0,84D,
где D - граница абсолютной погрешности, мг/дм3;
где δ - граница относительнойпогрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазономконцентраций, табл. 1), %.
Результатконтроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
где 
- среднее арифметическоерезультатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11)содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрациядобавки, соответственно, мг/дм3.
Норматив контроля Крассчитывают по формуле
,
Проводятсопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроляпроцедуры удовлетворяет условию
|Кк| ≤ К, (2)
процедуруанализа признают удовлетворительной.
При невыполненииусловия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия(2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, ипринимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемостирезультатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождениемежду результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должнопревышать предела воспроизводимости (R)
(3)
где X1, Х2 -результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/дм3;
R - предел воспроизводимости(в соответствии с диапазоном концентраций, табл.1), %.
