Федеральная служба по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
изопропилфенацина в воде
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК4.1.2292-07

1.Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина,Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

2.Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическомунормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителейи благополучия человека (протокол от 21.06.2007 № 2).

3.Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачомРоссийской Федерации Г.Г. Онищенко 10 октября 2007 г.

4.Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5.Введены впервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко

10 октября 2007 г.

Дата введения: 25 декабря 2007 г.

4.1.МЕТОДЫКОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определениеостаточных количеств изопропилфенацина в воде
методомвысокоэффективной жидкостной хроматографии

Настоящиеметодические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостнойхроматографии для определения в воде массовой концентрации изопропилфенацина вдиапазоне 0,0002-0,004 мг/дм³.

2-(α-фенил-изопропилфенил)-ацетил)-индан-1,3-дион(IUРАС)
С₃Н₇

С₂₆Н₂₂О₃

Мол. масса 382,15

Твердое веществожелто-оранжевого цвета. Температура плавления 148°С, кипения - более 350°С.Плотность 1,21 г/см³. Хорошо растворим в большинстве органическихрастворителей (ацетоне, этаноле, диэтиловом эфире и др.). Практически нерастворим в воде - 0,3 мг/дм³.

Агрегатноесостояние в воздушной среде - аэрозоль и пары.

Остраяпероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 1,6±0,2 мг/кг,мышей - 3,4±0,5 мг/кг.

Областьприменения

Изопропилфенацин- ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью,рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) назимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковыенасаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона.Применяется в виде приманки.

ОДУизопропилфенацина в воде водоемов - 0,0008 мг/дм³.

1. Метрологические характеристики

Присоблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точномсоответствии с данной методикой погрешность (и её составляющие) результатов измеренийпри доверительной вероятности Р = 0,95не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующихдиапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n=20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартноеотклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методикаоснована на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции изанализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта напатроне для твердофазной экстракции Sep Pak Silica.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы иматериалы

3.1. Средства измерений

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшимихарактеристиками.

3.2. Реактивы

Допускается использованиереактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Допускается применение хроматографических колонок и другогооборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1.При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасностипри работе с химическими реактивами по ГОСТ12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками поГОСТ12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации нажидкостный хроматограф.

4.2.Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм,установленных ГН2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ ввоздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

Квыполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не нижелаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведениюпробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опытработы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполненииизмерений соблюдают следующие условия:

-процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят притемпературе воздуха (20±5)°С и относительной влажности не более 80%.

-выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях,рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органическихрастворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ,кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов дляградуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовкапатронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведениявещества на них, отбор проб.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрилкипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, послечего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторноперегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата

Этилацетатпромывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщеннымраствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняютили подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретическихтарелок не менее 50.

7.1.3.Очистка н-гексана

Растворительпоследовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до техпор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральнойреакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбувместимостью 1000 см³ помещают 890 см³ ацетонитрила, 110см³ бидистиллированной или деионизованной воды и 1 см³ ортофосфорнойкислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промываютколонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачирастворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и раствороввнесения

7.4.1. Исходный раствор изопропилфенацина для градуировки (концентрация100 мкг/см³)

В мерную колбувместимостью 100 см³ вносят 0,01 г изопропилфенацина, добавляют50-70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом дометки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1-5 готовятобъемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор № 1 изопропилфенацина для градуировки и внесения(концентрация 10 мкг/см³)

В мерную колбувместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствораизопропилфенацина с концентрацией 100 мкг/см³ (п. 7.4.1), разбавляютацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течениемесяца.

Этот раствориспользуют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечениядействующего вещества методом «внесено-найдено».

7.4.3. Рабочие растворы № 2-5 изопропилфенацина для градуировки(концентрация 0,05-1,0 мкг/см³)

В 4 мерныеколбы вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 см³градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2),доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают,получают рабочие растворы №№ 2-5 с концентрацией изопропилфенацина 0,05; 0,1;0,5 и 1,0 мкг/см³, соответственно.

Растворыхранятся в холодильнике в течение недели.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочнуюхарактеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость суммыплощадей 2 пиков орто- и параизомеров изопропилфенацина (мкВ·с) от концентрациивещества в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютнойкалибровки по 4-м растворам для градуировки №№ 2-5.

В инжекторхроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора ианализируют в условиях хроматографирования по п. 7.5.1. Осуществляют не менее 3параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующеговещества, рассчитывают сумму площадей орто- и параизомеров изопропилфенацина.

Градуировочныйграфик проверяют ежедневно по анализу 2 растворов для градуировки различнойконцентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных,заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используясвежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

7.6. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбувместимостью 100 см³ помещают 50-70 см³ этилацетата,вносят 2 см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательноперемешивают.

7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep-Pak Plus Silica дляочистки экстракта

Патрон Sep-Pak Plus Silica устанавливают на аллонж спрямым отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюераобъемом не менее 10 см³, используемый в качестве емкости дляэлюента.

Концентрирующийпатрон промывают последовательно 5 см³ этилацетата, затем 5 см³смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованиемвакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин,при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Примечание: В отсутствии специальногоаллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скоростьпродавливания раствора не должна превышать 1-2 капли в сек.

7.8. Проверка хроматографического поведения изопропилфенацинана концентрирующем
патроне Sep-Pak Plus Silica

В круглодоннуюколбу вместимостью 10 см³ помещают 0,2 см³ градуировочногораствора №1 изопропилфенацина (п. 7.4.2),растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35°С, остаток растворяютв 2 см³ этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую баню. Затем вколбу добавляют 2 см³ гексана, смесь тщательно перемешивают и вносятна концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбуобмывают 5 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносятна патрон. Патрон дополнительно промывают 15 см³ смесигексан-этилацетат (1:1, по объему), 20 см³ смеси этих жерастворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 см³ этилацетата.Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1-2 капли в сек.Элюат отбрасывают.

Изопропилфенацинэлюируют с патрона 25 см³ 2% уксусной кислоты в этилацетате (п.7.6), собирая 5 порций элюата по 5 см³ каждая непосредственно вкруглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше35°С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2 см³ подвижной фазы(приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержаниеизопропилфенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие изопропилфенацин, объединяют ивновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полнотусмывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверкухроматографического поведения изопропилфенацина следует проводить обязательно,поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партиипатронов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор пробпроизводится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общиетребования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора пробсельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей средыдля определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Пробы водыанализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике притемпературе 4-6°С в течение 10недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовойтаре в морозильной камере при температуре -18°С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образецанализируемой воды объемом 500 см³ помещают в делительную воронку,вместимостью 1000 см³, добавляют 75 см³ хлористого метилена,интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полногоразделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу,вместимостью 250 см³, фильтруя его через 2 см слой безводногосульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм,снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазыповторяют, еще дважды порциями этилацетата по 50 см³. Отстоявшийсяслой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученнымэкстрактом.

Объединенныйэкстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше40°С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта

Сухой остаток вколбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 см³ этилацетата, помещаютна 30с в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 см³ гексана,смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Plus Silica, подготовленный по п.7.7. Колбу обмывают 5 см³ смесигексан-этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрондополнительно промывают 15 см³ смеси гексан-этилацетат (1:1, пообъему), 20 см³ смеси этих же растворителей в объемном соотношении3:7, затем 20 см³ этилацетата. Скорость прохождения раствора черезпатрон не должна превышать 1-2 капли в сек. Элюат отбрасывают.

Изопропилфенацинэлюируют с патрона 20 см³ 2% уксусной кислоты в этилацетате (п.7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упариваютдосуха при температуре не выше 35°С. Остаток в колбе растворяют в 2 см³подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержаниеизопропилфенацина по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Измерениявыполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостнойхроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters,США).

Хроматографическаяколонка стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry®С18, зернением 5 мкм.

Температураколонки: комнатная.

Подвижная фаза:ацетонитрил-вода-орто-фосфорная кислота (89:11:0,1, по объему).

Скорость потокаэлюента: 1,0 см³/мин.

Рабочая длинаволны: 312 нм.

Чувствительность:0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимойпробы: 20 мм³.

Ориентировочноевремя выхода изопропилфенацина:

- орто-изомер:7,72-8,01 мин

- пара-изомер:9,14-9,45 мин.

Линейныйдиапазон детектирования: 1-20 нг.

Образцы, дающиепики, большие, чем градуировочный раствор изопропилфенацина с концентрацией 1 мкг/см³,разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание изопропилфенацинав пробе рассчитывают по формуле:

где Х- содержаниеизопропилфенацина в пробе, мг/дм³;

A -концентрация изопропилфенацина, найденная по градуировочному графику, всоответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков орто- ипараизомеров, мкг/см³;

W - объемэкстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

V - объем анализируемого образца воды, см³.

11. Проверка приемлемости результатов параллельныхопределений

За результат анализапринимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений,расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                                                                                                  (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельныхопределений, мг/дм³;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r=2,8 σ_r.При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости,устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результатанализа представляют в виде:

 мг/дм³ при вероятности Р=0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми,мг/дм³;

Δ -граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

где δ- граница относительной погрешности методики (показатель точности всоответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае еслисодержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций,результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/дм³»*

__________________

*0,0002 мг/дм³- предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измеренийосуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность(правильность и прецинзионность) методов и результатов измерений».

13.1.Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений,анализируя один из градуировочных растворов.

13.2.Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализапроводится методом добавок.

Величинадобавки С_д должна удовлетворять условию:

где  - характеристика погрешности(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержаниюкомпонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента вобразце с добавкой соответственно) мг/дм³, при этом:

D_л = ± 0,84D,

где D - граница абсолютной погрешности, мг/дм³;

где δ - граница относительнойпогрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазономконцентраций, табл. 1), %.

Результатконтроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где  - среднее арифметическоерезультатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11)содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрациядобавки, соответственно, мг/дм³.

Норматив контроля Крассчитывают по формуле

,

Проводятсопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроляпроцедуры удовлетворяет условию

|К_к| ≤ К,                                                                                                                   (2)

процедуруанализа признают удовлетворительной.

При невыполненииусловия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия(2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, ипринимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемостирезультатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождениемежду результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должнопревышать предела воспроизводимости (R)

                                                                                            (3)

где X₁, Х₂ -результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/дм³;

R - предел воспроизводимости(в соответствии с диапазоном концентраций, табл.1), %.