| ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО
ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ |
| 
| НАЦИОНАЛЬНЫЙ
СТАНДАРТ
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ | ГОСТ Р
53097-
2008 (ИСО 6870:2002) |
КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ
Определение содержания зеараленона
ISO 6870:2002
Animal feeding stuffs -
Qualitative determinationof zearalenone
(MOD)
| 
| Москва Стандартинформ 2009 |
Предисловие
Цели и принципы стандартизации вРоссийской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правилаприменения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р1.0-2004 «Стандартизация вРоссийской Федерации. Основные положения»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО«Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») наоснове русской версии стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническимкомитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукциина безопасность»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕНВ ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию иметрологии от 18 декабря 2008 г. № 504-ст
4 Настоящий стандартявляется модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 6870:2002«Корма для животных. Качественный метод определения зеараленона» (ISO 6870:2002 «Animal feeding stuffs. Qualitative determinationof zearalenone»).
При этом измененные и дополнительные слова, фразы,абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальнойэкономики Российской Федерации и особенностей российской национальнойстандартизации, выделены курсивом
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандартупубликуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальныестандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемыхинформационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра(замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будетопубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальныестандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются такжев информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федеральногоагентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
СОДЕРЖАНИЕ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Определение содержания зеараленона Animal feeding stuffs. Determination of zearalenone |
Дата введения - 2010-01-01
Настоящий стандарт устанавливаеткачественный метод определениязеараленона в кормах для животных, в частности, в кукурузе. Данный методиспользуется только для целей скрининга. Предел определения зеараленона не более50 мкг/кг.
Примечание - Несмотря на то, что сорго дает мешающие флуоресцирующие пятна,идентичные пятнам зеараленона, данный метод тем не менее применяется дляданного корма, потому что значения ffyразличны послепроявления хроматограммы во втором направлении. Флуоресцирующие пятна непроявляются в случае использования установленного метода подтверждения.
В настоящем стандартеиспользованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО52501-2005 (ИСО 52501:2005) Вода для лабораторного анализа. Технические условия
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислотауксусная. Технические условия
ГОСТ 3118-77Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4197-74 Реактивы.Натрий азотистокислый. Технические условия
ГОСТ 9293-74 (ИСО2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 12433-83 Изооктаныэталонные. Технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Техническиеусловия
Примечание - При пользовании настоящим стандартомцелесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системеобщего пользования - на официальном сайте Федерального агентства потехническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодноиздаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», которыйопубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующимежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году.Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящимстандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Еслиссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка нанего, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
Испытуемую пробу кормаэкстрагируют смесью ацетонитрила и раствором хлорида калия, затем фильтруют иобезжиривают изооктаном, после чего производят очистку в смеси ацетонитрила,воды и ацетата свинца в присутствии диатомовой земли. После фильтрации пробуэкстрагируют хлороформом, который затем выпаривают.
Сухой экстракт растворяют в смесибензола и ацетонитрила. Осуществляют двумерную тонкослойную хроматографию испытуемойпробы. Содержание зеараленона определяют визуальным измерением илиизмерением интенсивности флуоресценции пятна в УФ-свете путем сравнения сизвестными количествами зеараленона, нанесенными на туже пластинку.
Идентичность зеараленонаподтверждают с помощью раствора бис-диазотированного бензидина.
При испытании используют толькореактивы аналитической чистоты и дистиллированную или деминерализованную водулибо воду эквивалентной чистоты по ГОСТ Р ИСО 52501.
4.1 Ацетонитрил дляхроматографии.
4.2 Изооктан по ГОСТ 12433.
4.3 Хлороформ по ГОСТ 20015.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Хлороформ - токсичное вещество.Необходимо избегать вдыхания или воздействия хлороформа. При работе с ним илиего растворами необходимо использовать вытяжной шкаф.
4.4Бензол/ацетонитрил, смесь 98:2, по объему.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Бензол токсичен при вдыхании иконтакте с кожей, а также легко воспламеняется.
4.5 Элюенты
4.5.1Толуол/этилацетат/муравьиная кислота, смесь 6:3:1, по объему.
4.5.2Хлороформ/этанол, смесь 95:5, по объему.
4.6 Хлорид калия,раствор массовой концентрации 40 г/дм3.
4.7 Раствор ацетатасвинца, приготовленный следующим образом: 200 г ацетата свинца помещают вмерную колбу вместимостью 1000 см3с одной меткой, добавляют3 см3уксусной кислоты по ГОСТ 61, доливают воду дометки и перемешивают.
4.8 Реагентбис-диазотированный бензидин
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Бензидин - канцероген и токсиченпри вдыхании, контакте с кожей и попадании внутрь организма.
4.8.1 Приготовлениераствора бензидина концентрацией 5 г/дм3
0,5 г бензидина помещают в колбувместимостью 100 см3, содержащую 20 см3водыи 1,5 см3 соляной кислоты по ГОСТ 3118,добиваются растворения бензидина и доливают воду до метки. Раствор хранят втемноте в склянках из коричневого стекла.
4.8.2 Приготовление растворабензидина
Равные объемы раствора бензидина(см. 4.8.1) и раствора нитрита натрия (натрий азотистокислый по ГОСТ 4197)концентрацией 100 г/дм3 охлаждают до температуры от 0 °С до 5 °С.
Растворы тщательно смешивают. Полученный растворстановится темно-фиолетовым и мутнеет. Раствор оставляют, чтобы доиспользования он достиг комнатной температуры (желтого цвета).
Реагент готовят непосредственноперед использованием.
4.9 Диатомовая земля(Целит 545), промытая соляной кислотой.
4.10 Азот газообразныйпо ГОСТ9293
4.11 Зеараленон,стандартный раствор массовой концентрации 10 мкг/см3, вбензоле.
Спектр поглощения растворарегистрируют между 300 и 330 нм на спектрометре при использовании кварцевыхоптических кювет толщиной 10 мм относительно бензола. Фиксируют максимальнуюоптическую плотность А, которая наблюдается вблизи 317 нм.
Рассчитывают концентрациюзеараленона, в микрограммах на миллилитр раствора, по формуле
(1)
где 318 - молярная массазеараленона;
А - максимальная оптическая плотность;
6060 - молярный коэффициентпоглощения.
Для испытаний используютследующее лабораторное оборудование:
5.1 Мельница, пригодная дляприготовления продукта, который полностью просеивается через сито с размеромотверстий 1 мм.
5.2 Аппарат длявстряхивания (шейкер), способный производить около 100 встряхиваний в минуту.
5.3 Фильтровальнаябумага с порами среднего размера («белаялента»). Фильтровальная бумагабыстрой фильтрации («красная лента») даст мутный раствор; фильтровальнаябумага медленной фильтрации («синяя лента») будет закупорена.
5.4 Роторный испаритель скруглодонной колбой.
5.5 Оборудование длятонкослойной хроматографии, нанесения пятен (капиллярные пипетки илимикрошприцы), проявительная камера и оборудование для распыления реагента напластинках.
5.6 Стеклянныепластинки для тонкослойной хроматографии, размером 200 × 200 мм, которые готовят, как указано ниже(указанные количества достаточны для приготовления пяти пластинок).
30 г силикагеля G-HR взвешивают вконической колбе, добавляют 60 см3воды, закрывают пробкой итщательно перемешивают в течение 1 мин. Суспензию разливают по пластинкам такимобразом, чтобы образовался равномерный слой толщиной 0,25 мм. Пластинкам даютвысохнуть на воздухе и помещают их в эксикатор. Пластинки активируют передиспользованием, помещая их на 1 час в сушильный шкаф, в котором поддерживаетсятемпература 110 °С ± 3 °С.
Если получаемые результатысопоставимы с результатами, получаемыми при использовании пластинок,приготовленных по методу, изложенному в предыдущем абзаце, можно использоватьпластинки, которые имеются в продаже.
5.7 КоротковолноваяУФ-лампа (длина волны 253 нм).
Интенсивность излучения должнабыть такой, чтобы можно было четко различить пятно, содержащее 25 нгзеараленона на тонкослойной пластинке, когда лампа размещена на расстоянии 100мм от пластинки.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! В связи с опасностью УФ-излучениядля глаз, необходимо использовать средства защиты глаз.
5.8 Пробирки, вместимостью10 см3, с полиэтиленовыми пробками.
5.9 Флуороденситометр (егоиспользование необязательно, но желательно).
5.10 Водяная баня,поддерживающая температуру (60± 1) °С.
5.11 Коническаяколба, вместимостью 500 см3, с пришлифованнойстеклянной пробкой.
5.12 Делительныеворонки, вместимостью 250 см3.
5.13 Мерные цилиндры,вместимостью 100 и 250 см3.
5.14 Пипетки, вместимостью50 и 100 см3.
5.15 Микрошприцы.
Лабораторную пробу продукции отбирают для испытаний его всоответствии со стандартом, распространяющимся на данную продукцию, заисключением тех случаев, когда отбор образцов для определения зеараленонаисключен из области его применения.
Образец измельчают так, чтобы онполностью просеивался через сито с размером отверстий 1 мм. Тщательноперемешивают.
50 г образца для испытаний взвешиваютс точностью до 0,01 г в конической колбе вместимостью 500 см3.
В коническую колбу собразцом добавляют 180 см3ацетонитрила и 20 см3раствора хлорида калия, тщательно отмеренных в мерном цилиндре. Колбузакрывают пробкой, перемешивают и подвергают встряхиванию во встряхивающемаппарате в течение 30 мин.
Полученный раствор фильтруютчерез фильтровальную бумагу.
100 см3фильтратапри помощи пипетки переносят в делительную воронку (см. 5.12) и обезжиривают,проводя две последовательные экстракции порциями по 50 см3изооктанакаждая.
Фазу ацетонитрила собирают вкруглодонной колбе роторного испарителя и выпаривают до сухого остатка припониженном давлении.
К полученному остатку добавляют20 см3ацетонитрила, 60 см3воды и 20 см3раствора ацетата свинца, тщательно отмеренного в мерном цилиндре. Перемешиваюти выдерживают в течение 10 мин на водяной бане, температуру которойподдерживают на уровне 60 °С. Образуется осадок. Добавляют 5 г диатомовой землии фильтруют через фильтровальную бумагу.
50 см3фильтратапри помощи пипетки переносят в делительную воронку и проводят трипоследовательные экстракции, используя при каждой 50 см3 хлороформа.Хлороформные фракции высушивают при помощи сульфата натрия. Далее высушенныехлороформные фракции собирают в круглодонной колбе роторного испарителя ииспаряют практически до сухого остатка при пониженном давлении.
Остаток количественно переносят впробирку, промывая хлороформом, затем испаряют до сухого состояния в атмосфереазота на водяной бане.
Микрошприцом осторожно добавляют0,5 см3смеси бензол/ацетонитрил (см. 4.4) и плотно закрываютпробирку.
7.5.1 Нанесениерастворов (см. рисунок 1)
На пластинке чертят две прямые линии, параллельныеприлежащим сторонам (на расстоянии 50 и 60 мм, соответственно, от края), чтобыобозначить предел перемещения фронта растворителя. При помощи микрошприцов напластинку наносят следующие растворы:
- в точку А - 25 мклочищенного экстракта;
- в точку В - 10 мклстандартного раствора;
- в точку С - 5 мклстандартного раствора;
- в точку D - 10 мклстандартного раствора;
- в точку Е - 15 мклстандартного раствора.
Пластинки высушивают в потокевоздуха или азота. Диаметр образующихся пятен не должен превышать 5 мм.
7.5.2 Проявление (элюирование)(см. рисунок 1)
Проводят элюирование в направлении I, используя элюент (слой 10 мм в насыщеннойкамере, защищенной от света), пока фронт растворителя не достигнет обозначеннойлинии. Пластинку удаляют из камеры и дают ей высохнуть в течение 15мин при комнатной температуре, предохраняя ее от действия света.
Рисунок 1 -Применение растворов и проявление хроматограммы
После элюирования внаправлении I может быть полезным краткий просмотр хроматограммыпод ультрафиолетовым излучением с длиной волны 253 нм и обозначение контуроввозможных пятен зеараленона слегка карандашом (пятно в точке В показываетрасположение зеараленона).
Далее проводят элюирование внаправлении II, используя элюент(слой 10 мм в ненасыщенной камере, защищенной от света), пока фронтрастворителя не достигнет обозначенной линии. Пластинку удаляют из камеры идают ей высохнуть при комнатной температуре, предохраняя ее от действия света.
7.6.1 Общие замечания
Для определения присутствиязеараленона можно использовать два метода: визуальную оценку интенсивностифлуоресценции пятна и флуороденситометрическое измерение. При наличиинадлежащего оборудования последний метод является предпочтительным.
7.6.2 Визуальная оценка
Содержание зеараленона в образцеопределяют путем сравнения интенсивности флуоресценции под УФ-излучением пятнаэкстракта с интенсивностью пятен С, D и Естандартного раствора, при размещении пластинки на расстоянии 10 см отУФ-лампы. При необходимости проводят интерполяцию.
Если интенсивность флуоресценции25 мкл экстракта больше, чем 15 мкл стандартного раствора, используют меньшийобъем раствора в точке А или разбавляют экстракт смесьюбензол/ацетонитрил) и проводят повторную тонкослойную хроматографию.
7.6.3 Флуороденситометрическоеизмерение
Интенсивность флуоресценции пятенизмеряют с помощью флуороденситометра при длине волны возбуждения 313 нм идлине волны излучения 443 нм (максимальное излучение при 470 нм).
Содержание зеараленона в образцеопределяют путем сравнения интенсивности флуоресценции пятна экстракта синтенсивностями пятен С, D и Е стандартногораствора.
На пластинку распыляют реагентбис-диазотированный бензидин. Зеараленон образует яркое кирпично-красное пятнопри комнатной температуре, которое исчезает при выдержке на воздухе в течение15 мин.
Содержание зеараленона В,выраженное в микрограммах на килограмм продукции, рассчитывают по формуле:
(2)
где с - массовая концентрациязеараленона, в микрограммах на миллилитр стандартного раствора;
т - масса испытуемой пробы, соответствующей объемуэкстракта, который проходит очистку (12,5 г), г;
V1 - конечный объем экстракта с учетом возможныхразбавлений, в микролитрах;
V2 и \/3 - объемы экстракта и стандартного раствора зеараленонасоответственно, наносимые на пластинку, которые показывают аналогичнуюинтенсивность флуоресценции, в микролитрах.
Содержание зеараленона В1,выраженное в микрограммах на килограмм продукции, рассчитывают по формуле
(3)
где т - масса испытуемойпробы, соответствующей объему экстракта, который проходит очистку (12,5 г), г;
m1 - масса зеараленона в пятне экстракта (принимая вовнимание объем V2), установленная на основе определений, внанограммах;
V1 - конечный объем экстракта, в микролитрах;
V2 - объем экстракта, наносимого на пластинку, в микролитрах.
Подробности межлабораторныхиспытаний прецизионности данного метода приведены в приложении А.Значения, полученные на основе межлабораторных испытаний, могут бытьнеприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от тех, которые приведены.
