На главную
На главную

Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов

Методические указания устанавливают требования к проведению токсиколого-гигиенических исследований по оценке безопасности наноматериалов. Требования, изложенные в методических указаниях, применяются при осуществлении государственной регистрации продукции, полученной с использованием нанотехнологий или содержащей наноматериалы, впервые разрабатываемой и внедряемой для промышленного изготовления на территории Российской Федерации на этапе ее подготовки к производству, а также впервые ввозимой и ранее не реализовывавшейся - до ее ввоза на территорию Российской Федерации. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы токсиколого-гигиенической оценки безопасности наноматериалов. Методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, аккредитованными в установленном порядке.

Обозначение: МУ 1.2.2520-09
Название рус.: Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов
Статус: действует
Дата актуализации текста: 05.05.2017
Дата добавления в базу: 01.09.2013
Дата введения в действие: 05.06.2009
Утвержден: 05.06.2009 Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач РФ
Опубликован: Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора (2009 г. (4(38)))
Ссылки для скачивания:

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Токсиколого-гигиеническая оценка
безопасности наноматериалов

Методические указания
МУ 1.2.2520-09

1.Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей иблагополучия человека (Г.Г. Онищенко); ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А.Хотимченко, И.В. Гмошинский, И.В. Аксенов, Е.А. Арианова, В.В. Бессонов, В.М.Верников, М.М. Гаппаров, О.И. Передеряев); ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологииим. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (А.Л. Гинцбург, Б.С. Народицкий, М.М.Шмаров, Д.Ю. Логунов); Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (М.П. Кирпичников, К.В. Шайтан, А.П. Бонарцев, А.В. Феофанов, В.В.Воинова); Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. ЭрисманаРоспотребнадзора (А.И. Потапов, В.Н. Ракитский, А.В. Тулакин, Т.В. Юдина, Л.А.Луценко, Т.К. Татянюк, Г.В. Цыплакова, Л.П. Терешкова, О.В. Жигайло, Н.С.Белоедова, К.Б. Лохин, Н.И. Николаева, И.П. Громова, Е.В. Сарафанюк);Институтом биохимии им. А.Н. Баха РАН (В.О. Попов, Б.Б. Дзантиев, А.В. Жердев);ООО «Интерлаб» (А.Н. Веденин, Г.В. Казыдуб).

2.Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственномусанитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору всфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта2009 г. № 1).

3.Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты правпотребителей и благополучия человека, Главным санитарным врачом РоссийскойФедерации Г.Г. Онищенко 05 июня 2009 г.

4.Введены в действие с 05 июня 2009 г.

5.Введены впервые.

Содержание

1. Область применения

2. Нормативные ссылки

3. Общие положения

4. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих заявленные свойства наноматериалов

5. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов

6. Схема проведения экспериментов по изучению общетоксического действия наноматериалов

7. Проведение исследований по изучению отдаленных эффектов действия наноматериалов

8. Иммунологические исследования и оценка потенциальной аллергенности наноматериалов

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

05 июня 2009 г.

Дата введения: 05 июня 2009 г.

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов

Методические указания МУ 1.2.2520-09

1. Область применения

1.1. Настоящие методическиеуказания устанавливают требования к проведению токсиколого-гигиеническихисследований по оценке безопасности наноматериалов.

1.2. Требования, изложенные внастоящих методических указаниях, применяются при осуществлении государственнойрегистрации продукции, полученной с использованием нанотехнологий илисодержащей наноматериалы, впервые разрабатываемой и внедряемой дляпромышленного изготовления на территории Российской Федерации на этапе ееподготовки к производству, а также впервые ввозимой и ранее нереализовывавшейся - до ее ввоза на территорию Российской Федерации.

1.3. Методические указания разработаныс целью обеспечения единой, научно обоснованной системытоксиколого-гигиенической оценки безопасности наноматериалов.

1.4. Методические указания предназначены дляспециалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защитыправ потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованынаучно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскимиучебными заведениями и иными организациями и учреждениями, аккредитованными вустановленном порядке.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный законРоссийской Федерации от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «Осанитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2.2. Федеральный закон РоссийскойФедерации от 2 января 2000 г. № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевыхпродуктов».

2.3. Федеральный законРоссийской Федерации от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании».

2.4. Федеральный законРоссийской Федерации от 10 января 2002 г. № 7-ФЗ «Об охране окружающей среды».

2.5. ПостановлениеПравительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 987 «Огосударственном надзоре и контроле в области обеспечения качества ибезопасности пищевых продуктов».

2.6. ПостановлениеПравительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. № 988 «Огосударственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий».

2.7. ПостановлениеПравительства Российской Федерации от 18 мая 2002 г. № 320 «О подписанииРоссийской Федерацией Стокгольмской конвенции о стойких органическихзагрязнителях».

2.8. Постановление Главногогосударственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. № 54«О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий исодержащей наноматериалы».

2.9. Постановление Главного государственногосанитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. №79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологииоценки риска, методов идентификации и количественного определениянаноматериалов».

2.10. Приказ Министерстваздравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшемусовершенствованию организационных форм работы с использованиемэкспериментальных животных».

2.11. Приказ Министерстваздравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утвержденииПравил лабораторной практики» (зарегистрирован Минюстом России 25 июня 2003 г.№ 4809).

2.12. Приказ Федеральнойслужбы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от19 июля 2007 г. №224 «О санитарно-эпидемиологических экспертизах, обследованиях,исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видахоценок» (зарегистрирован Минюстом России 20 июля 2007 г. № 9866).

3. Общие положения

3.1. Проведение настоящихисследований определяется правилами надлежащей лабораторной практики.

3.2. Требования к исследуемымнаноматериалам.

3.2.1. Комплект документов наисследуемый наноматериал представляется заказчиком в соответствии с п.4.1 настоящих методических указаний с обозначением условий и сроковхранения, данных по стабильности, информации о мерах по обеспечениюбезопасности работы с исследуемым наноматериалом, растворителей и процедурырастворения или диспергирования.

3.2.2. Наноматериалы дляпроведения токсиколого-гигиенических исследований представляются заказчиком.

3.2.3. Исследуемыйнаноматериал должен быть упакован для защиты при транспортировании отзагрязнения или порчи.

3.2.4. Метод обнаружения,идентификации и количественного определения наноматериалов, позволяющийотличить их от аналогичных веществ в традиционной форме, представляется изготовителем.

3.2.5. Хранение исследуемыхобразцов наноматериалов осуществляется отдельно от веществ, реактивов,препаратов сравнения в соответствии с рекомендациями заказчика, с соблюдениемусловий хранения, указанных изготовителем на весь период срока годности.

3.2.6. Хранение и использованиеисследуемых наноматериалов осуществляется в соответствии с утвержденнымпротоколом исследования.

3.3. Требования к лабораторнымживотным и уходу за ними.

3.3.1. Все токсикологическиеисследования проводятся только на здоровых животных, прошедших карантин.

3.3.2. Все процедуры,связанные с уходом за лабораторными животными, подробно описываются встандартных операционных процедурах в п. 3.9 настоящих методическихуказаний.

3.3.3. Поступающих животныхнеобходимо изолировать для оценки состояния здоровья. Источники их поступления,условия и дата поступления должны быть документально оформлены. Всемероприятия, принимаемые в случае ухудшения состояния здоровья животных и ихгибели, не связанной с проведением исследования, осуществляются в соответствиис утвержденным протоколом исследования и должны быть документированы.

3.3.4. Для обеспеченияиндивидуального наблюдения в процессе выполнения исследования животные должныбыть идентифицированы путем их маркировки. Все клетки, вольеры, контейнеры,предназначенные для содержания животных, также подлежат маркировке. Животные,предназначенные для исследования различных наноматериалов, изолируются друг отдруга.

3.3.5. Места содержанияживотных и производственные помещения подвергаются периодической санитарнойобработке, за исключением указанных в утвержденном протоколе исследованиясредств, способных оказать влияние на результаты исследования.

3.4. Требования к помещениям,кормам и инвентарю должны соответствовать правилам лабораторной практики.

3.4.1. Помещения,предназначенные для проведения токсиколого-гигиенических исследованийнаноматериалов, должны располагаться таким образом, чтобы обеспечитьвозможность выполнения проводимых исследований в полном объеме в соответствии сутвержденным протоколом исследования.

3.4.2. Помещения длялабораторных животных должны:

• обеспечиватьизоляцию (карантин) поступающих животных, больных животных и животных,подозреваемых в носительстве инфекций;

• позволять осуществлятьраздельное содержание различных видов животных и животных одного вида,являющихся объектом исследования различных наноматериалов;

• соответствоватьсанитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям.

3.4.3. Корма, оборудование иинвентарь для ухода за животными необходимо хранить в помещениях, изолированныхот мест содержания животных. Помещения для проведения исследованийнаноматериалов, в т.ч. для работы с опасными для здоровья и жизни человека объектамиисследования, должны соответствовать установленным санитарно-эпидемиологическимтребованиям.

3.4.4. Корма и вода дляживотных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с утвержденнымпротоколом исследования, быть свободными от патогенных микроорганизмов ивредных примесей и не должны влиять на результаты исследования.

3.5. Требования к используемому оборудованию.

3.5.1. Организации, проводящиетоксиколого-гигиенические исследования наноматериалов, должны быть оснащенынеобходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль и калибровку вустановленном порядке.

3.5.2. Эксплуатацияоборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией поприменению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируютсяв специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующимоборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.6. Планирование и проведениеисследований.

3.6.1.Токсиколого-гигиенические исследования наноматериалов проводятся поутвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в которыйзаносятся все результаты исследований.

3.6.2. Токсикологическиеисследования наноматериалов на животных проводятся в соответствии сустановленными правилами. Исполнителем должен быть обеспечен контроль засоблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных припроведении исследований наноматериалов в соответствии с утвержденнымпротоколом.

3.6.3.Токсиколого-гигиенические исследования по оценке безопасности наноматериаловпроводятся в соответствии с утвержденным протоколом. Протокол исследованияутверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает:цель и задачи исследования, имеющиеся сведения об исследуемом наноматериале(физические, химические, биологические, токсикологические свойства), условияхранения и использования исследуемых наноматериалов, сведения о контрольномматериале традиционной степени дисперсности (если таковой имеется), схемуисследования и обоснование избранной схемы исследования, методы исследования,способы и пути введения исследуемого и контрольного образцов, критерии оценкибезопасности исследуемого наноматериала, результаты исследований,статистическую обработку результатов исследования, заключение, список используемойлитературы.

Вносимые в протокол исследованияизменения утверждаются руководителем исследования, а отклонения от протокола(незапланированные события, непредвиденные обстоятельства и т.д.) записываются,пронумеровываются, подписываются руководителем исследования, датируются вприложении с указанием причин.

3.7. Требования к оформлениюотчета.

3.7.1. По окончаниипроведенных токсиколого-гигиенических исследований оформляется отчет, в которомдолжны быть представлены: название, адрес организации-исполнителя, даты началаи завершения исследований, цель и задачи исследования; описание исследуемогонаноматериала, включая имеющиеся сведения о физических, химических,биологических, токсикологических свойствах; вид, возраст, количество животных вкаждой группе, пол, показатели массы тела, источник питания; режим дозирования,форма, кратность и путь введения исследуемого наноматериала; схема проведенияисследования наноматериала; описание методов статистической обработкирезультатов, результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц,рисунков с соответствующей статистической обработкой, и комментариев к ним,обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы.

3.7.2. Отчет о результатахпроведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждаетсяруководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.8. Система обеспечениякачества токсиколого-гигиенических исследований по оценке безопасности наноматериалов.

3.8.1. Контроль за качеством проведениятоксиколого-гигиенических исследований наноматериалов включает в себяоформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием длякаждого исследования руководителя и заказчика, названия исследуемогонаноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий моментвремени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правиламлабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенныхпроверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.8.2. Для осуществления контролякачества руководство организации, проводящей токсиколого-гигиеническиеисследования по оценке безопасности наноматериалов, назначает в соответствии справилами надлежащей лабораторной практики ответственных лиц за мониторингисследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.9.Стандартные операционные процедуры.

3.9.1. Стандартныеоперационные процедуры разрабатываются организацией, проводящей исследованиянаноматериалов, на все производственные операции, в т.ч. поступление,идентификацию, маркировку, обработку, отбор проб, использование и хранениеисследуемых веществ; обслуживание и калибровку измерительных приборов иоборудования для контроля окружающей среды; приготовление реактивов, кормов;ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; принеобходимости обезвреживание или утилизацию наноматериалов; осуществлениепрограммы по обеспечению качества, и утверждаются руководителем организации.

3.9.2. Соблюдение стандартныхоперационных процедур осуществляется в целях обеспечения качества,достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

3.9.3. Отклонения отстандартных операционных процедур должны быть документально оформлены исогласованы с руководителем исследования.

3.9.4. Организация, проводящаяисследование наноматериалов, должна:

• иметь утвержденный порядокприема и учета поступления наноматериалов;

• проводить учетнаноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации;

• принимать меры пообеспечению идентификации исследуемых веществ (указание на упаковке названия,химической формулы, номера серии, даты выпуска, условий хранения и сроковгодности) и их стабильности на протяжении всего исследования.

3.10. Меры конфиденциальности.

3.10.1. Сотрудники,принимающие участие в проведении токсиколого-гигиенических исследованийнаноматериалов, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных,полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством РоссийскойФедерации.

3.10.2. Организация,проводящая исследования наноматериалов, должна обеспечить конфиденциальностьрезультатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии сзаконодательством Российской Федерации.

4. Экспертный анализ и оценка данных,характеризующих заявленные свойства наноматериалов

4.1. Общая характеристикананоматериалов включает анализ информации, представленной заявителем:

• область применения ирекомендуемые уровни внесения;

• торговое, химическое наименованиенаноматериала;

• точное название, адрес,реквизиты изготовителя;

• метод получения;

• состав наноматериала(название и формула (ы) вещества или веществ, входящих в его состав, его (их)молекулярная масса);

• сведения об идентичностипредставленного образца выпускаемой продукции;

• нормативно-техническаядокументация на отечественную продукцию, включая все конструкционные элементы;

• протоколы отдельных разделовтоксиколого-гигиенических испытаний на безопасность продукции (если таковыеимеются), выполненных в аккредитованных лабораториях;

• специфический методопределения наноматериалов в продукции;

• подробная рецептуракомпозиции для оценки многокомпонентных материалов, если наноматериал находитсяв растворителе или на носителе;

• реквизиты импортнойпродукции дополнительно должны содержать: сертификаты фирмы-производителя обезопасности продукции, протоколы испытаний в аккредитованных лабораториях(центрах) зарубежных стран;

• физические характеристикинаноматериалов (размер и распределение по размеру частиц, форма частиц, площадьповерхности, пористость, агрегатное состояние);

• физико-химическиехарактеристики наноматериалов (растворимость в воде и биологических жидкостях,заряд частиц, кристаллическая структура, адсорбционная емкость, устойчивость кагрегации, гидрофобность, адгезия наночастиц к поверхности, химическаяактивность (в т.ч. способность генерировать свободные радикалы), способность кбиодеструкции;

• молекулярно-биологическиехарактеристики (взаимодействие с ДНК, РНК, клеточными мембранами, белками);

• цитологическиехарактеристики (цитотоксичность, способность к накоплению в клетках, влияние напротеомный и метаболомный профиль);

• токсикологическиехарактеристики (потенциальные пути проникновения в организм, острая токсичность,подострая токсичность, хроническая токсичность, кумулятивное действие,местнораздражающее действие, отдаленные эффекты (мутагенность,эмбриотоксичность, тератогенность, канцерогенность), иммунотоксичность,аллергенность, накопление в органах и тканях, проницаемость барьеров организмадля токсикантов, проникновение через барьеры организма);

• разрешение уполномоченныхорганов страны-изготовителя на использование наноматериалов встранах-импортерах.

Все данные должны быть представлены нарусском языке, а сведения о химическом составе материала - в соответствии ссистематической номенклатурой IUРАС.

4.2. Анализ результатов оценкибезопасности наноматериалов проводится на основании данных ранее проведенныхисследований (если такие исследования проводились) и литературных данных,представленных заявителем.

4.3. Предварительная оценкастепени потенциальной опасности наноматериалов проводится в зависимости откласса их опасности.

4.4. Объем проводимыхисследований наноматериалов определяется в зависимости от степени ихпотенциальной опасности.

5. Токсиколого-гигиеническая оценка
безопасности наноматериалов

5.1. Перечень и объемтоксиколого-гигиенических исследований определяются экспертными (учеными)советами соответствующих аккредитованных испытательных центров РоссийскойФедерации на основании анализа представленных материалов и оценки степенипотенциальной опасности наноматериалов.

5.2. Гигиеническиеисследования наноматериалов включают определение показателей качества ибезопасности:

• содержание основного вещества;

• содержание примесей;

• содержание растворителей илиносителей (если они использовались);

• при необходимости содержание токсичныхэлементов, пестицидов, радионуклидов, микробиологические и другие показатели.

5.3. Токсикологическиеисследования наноматериалов проводятся в эксперименте на здоровых половозрелыхживотных, прошедших карантин в течение не менее 10 дней.

5.4. Токсикологическиеисследования можно проводить как на линейных (крысы линий Wistar, Sprague-Dawley и др.;мыши линий СВА, С57В1/6 и др.), так и нелинейных животных. В случаеиспользования линейных животных необходимо указать линию животных.

5.5. Количество животных вгруппе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10 особей вгруппе.

5.6. Разброс по исходной массетела животных в группе не должен превышать ± 10 %.

5.7. В течение всегоэксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде.

5.8. Дляунификации исследований животные на протяжении всего эксперимента получаютполусинтетический рацион. Продуктовый набор рациона представлен в таблицах 1-4.

Таблица 1

Составполусинтетического рациона

Компоненты

Масса ингредиентов
(г на 100 г диеты)

Казеин

20,0

Крахмал маисовый

63,5

Масло растительное (подсолнечное)

5,0

Лярд

5,0

Солевая смесь

3,5

Сухая смесь водорастворимых витаминов

0,9

Смесь жирорастворимых витаминов (масляный раствор)

0,1

Микрокристаллическая целлюлоза

2,0

Таблица 2

Смесь жирорастворимыхвитаминов

Витамины

Объем (мл на 100 мл смеси)

Витамин Е (токоферол 50 мг/мл)

10

Витамин А (ретинол 100000 и.е./мл)

1,4

Витамин D (эргокальциферол 50000 и.е./мл)

1,4

Рыбий жир

87,2

Таблица 3

Смесь водорастворимыхвитаминов

Витамины

Содержание (мг на 100 г смеси)

Тиамин гидрохлорид

500

Рибофлавин

500

Пиридоксин гидрохлорид

500

Никотинамид

2000

Кальция пантотенат

2000

Фолиевая кислота

200

Биотин

10

Викасол, 1 %

100

Цианокобаламин

1,5

Сахароза

до 100 г

Таблица 4

Смесьминеральных солей

Минеральные соли

Содержание,
(г на 100 г смеси)

Кальций фосфорнокислый, Са3(PO4)2

50,0

Натрий хлористый, NaCl

7,4

Калий лимонно-кислый моногидрат, C6H5O7K3 × Н2O

22,0

Калий серно-кислый, K2SO4

5,2

Магний окись, MgO

2,4

Марганец углекислый, (Мn 43-48 %)

0,35

Железо лимонно-кислое, C6H5O7Fe (Fe 16-17 %)

0,6

Цинк углекислый, ZnCO3 (Zn 70 %)

0,16

Медь углекислая, (Си 53-55 %)

0,03

Йодисто-кислый калий, КIO3

0,001

Селенисто-кислый натрий, Na2SeO3

0,001

Хромовокалиевые квасцы, CrK(SO4)2 × 12Н20

0,058

Сахароза (высокоочищенная)

11,8

5.9. Данные исследования проводятсяс целью установления уровней воздействия, при которых не наблюдаются вредныеэффекты (NOAEL или NOEL), которыемогут быть использованы для обоснования допустимого суточного поступления,допустимых пределов содержания наноматериалов в пищевых продуктах, воде ивоздухе.

6. Схема проведения экспериментов по изучениюобщетоксического действия наноматериалов

6.1. Определение острой токсичности.

Целью является определение переносимых, токсическихи летальных доз наноматериалов и причин гибели животных после однократноговведения исследуемого наноматериала.

6.1.1. Количество мелкихЛабораторных животных в группе должно обеспечить возможность вычисления LD50, CL50 кожно-резорбтивного действия (не менее 10 особей вгруппе).

6.1.2. Введение наноматериаловлабораторным животным осуществляется путем, который предполагается прииспользовании наноматериалов в дальнейшем или при котором наноматериалвоздействует на человека: наноматериалы для приема внутрь вводятся в составекорма или зондом; для местного применения - наносят на кожу; при ингаляционномвведении лабораторных животных помещают в затравочные камеры, снабженныеспециальными затравочными устройствами, или применяют внутритрахеальное, внутриглоточноеили внутригортанное ингаляционное введение с использованием специальныхустройств. Количество наноматериала рассчитывают на единицу массы телаживотного или на площадь поверхности при нанесении на кожу или в мг/м приингаляционном воздействии. Для выражения количества наноматериала используютединицы массы наноматериала (мг). Дополнительно для выражения количествананоматериала можно использовать такие параметры, как отношение количествачастиц к массе наноматериала (1012мг-1) и отношение площадиповерхности частиц к массе наноматериала (см2/мг).

6.1.3. Если наноматериалынаходятся в растворителе или на носителе, то заказчиком исследованияпредставляются токсикологические характеристики этого растворителя илиносителя. При необходимости проводятся исследования острой токсичности самогорастворителя (носителя), который вводится перорально, ингаляционно илинаносится на кожу (в зависимости от предполагаемого пути поступленияисследуемого наноматериала) в той же дозировке, что и в составе исследуемогообразца наноматериала.

6.1.4. Для изучения остройтоксичности используют белых крыс с исходной массой тела 180-240 г или мышей сисходной массой тела 18-24 г (отдельно самцов и самок).

6.1.5. Общая продолжительностьнаблюдения составляет 14 дней, при этом фиксируются общее состояние животных,клиническая картина интоксикации и гибели, характер двигательной активности ипоходки, наличие и характер судорог, тонус скелетных мышц, реакция на различныераздражители, частота и глубина дыхательных движений, ритм сердечныхсокращений, состояние волосяного и кожного покрова, положение хвоста, частотамочеиспускания и окраска мочи, потребление корма и воды, изменения массы тела.Регистрируется время гибели животных, при этом у всех погибших животныхпроводятся макроскопическое и микроскопическое исследование внутренних органов.

6.1.6. Основные параметрыострой токсичности могут быть вычислены с помощью любых статистических методов,например, методом Линфилда и Уилкоксона.

6.1.7. При определении остройтоксичности вычисляются LD16, LD50 и LD84 (при введении в желудок) или CL16, CL50 и CL84 (приингаляционном введении) отдельно для самцов и самок.

6.1.8. Параметры остройтоксичности выражают в мг/кг массы тела при пероральном пути введения или вмг/м при ингаляционном пути введения.

6.1.9. Если из-за низкойтоксичности испытуемого наноматериала нельзя определить LD50, тоуказывается максимальная доза, которая была введена животным.

6.2. Изучение кумуляции.

6.2.1. Изучение кумуляциипроводится на взрослых белых крысах или мышах в течение (24 ± 4) дней по Лимуили в течение 2-х мес. по Кагану Ю.С., Станкевичу В.В.

6.2.2. Для изучения кумуляциииспользуют белых крыс с исходной массой тела 180-240 г или мышей с исходноймассой тела 18-24 г. Интегральный показатель - смертность животных. Прииспользовании метода Кагана Ю.С., Станкевича В.В. кроме смертности оцениваютсяфизиологические, биохимические, гематологические и другие показатели.

6.2.3. Схема проведения исследования.

В первые 4 дня вводится доза, равная 0,1 отустановленной LD50. В следующие 4 дня доза увеличивается в 1,5 раза, вследующие 4 дня - еще в 1,5 раза и т.д. При использовании метода Кагана Ю.С.,Станкевича В.В. - исследуемый наноматериал вводят в дозе 0,1 LD50 втечение 2-х мес.

6.2.4. Коэффициент кумуляциивычисляется как отношение средней смертельной дозы при n-кратном введении к средней смертельной дозе приоднократном введении.

6.2.5. Величина коэффициентаменее 1 свидетельствует о наличии кумулятивных свойств, а более 1 - об эффекте привыканияпри использовании метода Лима. В случае использования метода Кагана Ю.С.,Станкевича В.В. используется следующая классификация опасности:

• 1 класс (чрезвычайноопасные) - < 1;

• 2 класс (высоко опасные) -1-3;

• 3 класс (умеренно опасные) -1-5;

• 4 класс (мало опасные) -> 5.

6.3. Определение подостройтоксичности.

Целью является получениеинформации об основных токсических эффектах наноматериалов, поражаемых органах-мишенях, латентном периодеразвития эффектов в зависимости от дозы и обратимости эффектов. Подострыйэксперимент является дополнительным (вспомогательным). Полученные в ходе этихисследований данные используются в дальнейшем для планирования тестов нахроническую токсичность. В случае использования метода Кагана Ю.С., СтанкевичаВ.В. определение подострой токсичности может не проводиться.

6.3.1. Введение наноматериаловлабораторным животным осуществляют такимпутем, который предполагается при использовании наноматериалов вдальнейшем или при которомнаноматериал воздействует на человека.

Изучаемые наноматериалы должны вводитьсяежедневно на протяжении всего периода эксперимента. Количество наноматериаларассчитывают на единицу массы телаживотного при пероральном введении или на площадь поверхности при нанесении на кожу или в мг/м3при ингаляционном воздействии.

В течение всего эксперимента должныиспользоваться образцы наноматериалов однойи той же партии.

6.3.2. Для изучения подостройтоксичности используют белых крыс с исходноймассой тела 40-50 г.

6.3.3. Общая продолжительностьисследования составляет 90 дней для крыс, при этом фиксируются общее состояниеживотных, характер двигательной активности, состояние волосяного и кожногопокрова, потребление корма и воды, диурез, изменения массы тела.

В случае гибели животных во время проведенияэксперимента у всех погибших животных проводятся макроскопическое имикроскопическое исследования внутренних органов с целью установления причингибели.

6.3.4. При выборе дозучитывается доза, установленная в остром опыте, выраженность кумулятивногодействия и литературные данные о наноматериалах, аналогичных исследуемым. Чащевсего испытываются 1/5 - 1/20 отустановленной в исследованиях LD50.

6.3.5. Изучаются 2-3 дозыисследуемого наноматериала. Самая высокая доза должна вызывать достоверныйтоксический эффект, а самая низкая - не вызывать токсического эффекта.

6.3.6. Схемы проведенияэкспериментов по определению подострой токсичности при различных путях введениянаноматериала.

6.3.6.1.Схема проведения эксперимента при пероральном введении.

Вид животных

Линейные или беспородные белые крысы-самцы (при необходимости дополнительно - крысы-самки)

Продолжительность эксперимента

90 дней для крыс

Карантин

Не менее 10 дней

Исходная масса тела

40-50 г

Рацион

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Количество животных в группе в начале эксперимента

Ориентировочно с учетом возможной гибели не менее 60

Описание экспериментальных групп

Группа 1 (контроль) - крысы на протяжении эксперимента находятся на контрольном полусинтетическом рационе и не экспонируются наноматериалами

Группа 2 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно высокую дозу изучаемого наноматериала

Группа 3 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно среднюю дозу изучаемого наноматериала

Группа 4 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно низкую дозу изучаемого наноматериала

Группа 5 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно высокую дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 2)

Группа 6 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно среднюю дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 3)

Группа 7 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно низкую дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 4)

Примечания.

1. Группы 5, 6, 7 формируются в том случае, если имеются вещества, аналогичные исследуемым наноматериалам, но полученные традиционным способом.

2. Если в составе вводимого препарата наноматериала присутствует растворитель или носитель, имеющий определенную токсикологическую характеристику, то дополнительно формируются

группы животных, которым вводится этот растворитель или носитель в той же дозировке, что и в составе вводимого препарата наноматериала.

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде и содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении в соответствии с установленными требованиями

Содержание животных

Не более чем по 5 крыс в клетке

Забор материалов для исследований

На 10, 30, 60 и 90-й дни эксперимента

Количество животных в группе, взятых на исследование на забое

Не менее 10 крыс в группе

6.3.6.2. Схема проведения эксперимента приингаляционном введении

Вид животных

Линейные или беспородные белые крысы-самцы (при необходимости дополнительно - крысы-самки).

Экспозиция и продолжительность эксперимента

4 ч в день, 5 раз в неделю на протяжении 4 мес.

Карантин

Не менее 10 дней

Исходная масса тела

150-175 г

Рацион

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Количество крыс в группе в начале эксперимента

Ориентировочно с учетом возможной гибели не менее 50

Описание экспериментальных групп

Группа 1 (контроль) - крысы находятся в затравочных камерах с ингалированием чистым воздухом

Группа 2 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала высокой дозы

Группа 3 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала средней дозы

Группа 4 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала низкой дозы

Группа 5 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, высокой дозы (контроль к группе 2)

Группа 6 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, средней дозы (контроль к группе 3)

Группа 7 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, низкой дозы (контроль к группе 4)

Примечание.

Группы 5, 6, 7 формируются в том случае, если имеются вещества, аналогичные исследуемым наноматериалам, но полученные традиционным способом.

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде и содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении в соответствии с установленными требованиями

Содержание животных

Не более чем по 5 крыс в клетке

Забор материалов для исследований

На 10-й, 30-й, 60-й и 90-й дни эксперимента

Количество крыс в группе, взятых на исследование на забое

Не менее 10 крыс в группе

6.3.7.В качестве исследуемых показателей используются показатели, изложенные в п. 6.4.7.3настоящих методических указаний.

6.4. Изучение токсичности наноматериаловв долгосрочных исследованиях.

6.4.1. Целью проведения длительноготоксикологического эксперимента является характеристика степени повреждающегодействия изучаемых наноматериалов при их длительном введении, выявлениенаиболее чувствительных органов и систем организма, определение степениобратимости вызываемых наноматериалами повреждений для выявления характеразависимости доза-ответ и уровней воздействия, при которых не наблюдаютсявредные эффекты.

6.4.2. Для изучениятоксичности в долгосрочных исследованиях используют белых крыс с исходноймассой тела 180-240 г или мышей с исходной массой тела 18-24 г. Можноиспользовать также кроликов, морских свинок, собак, свиней и обезьян.

6.4.3. При выборе дозучитывается доза, установленная в остром опыте, выраженность кумулятивногодействия и данные литературы о веществах, сходных с исследуемыми. Чаще всегоиспытываются 1/3 - 1/10 частиминимальной токсической дозы, но в ряде случаев возможно уменьшение количестваисследуемого вещества.

6.4.4. Изучаются 2-3 дозыисследуемого наноматериала. Самая высокая доза должна вызывать некоторыепризнаки токсичности, граничащие с физиологической нормой, а наименьшая доза недолжна давать проявления признаков токсичности.

6.4.5. Продолжительностьисследований зависит от поставленных в утвержденном протоколе исследованияцелей и задач с учетом продолжительности жизни животных.

Если исследованию подвергаютсянаноматериалы, которые будут долгое время соприкасаться с организмом человека,то длительность эксперимента должна быть не меньше 6-10 мес. для различныхлабораторных животных. При наличии способности наноматериала к кумуляции илиотнесении его к высокотоксичным по LD50 срок эксперимента может быть увеличен.

6.4.6. Способ введения.

Путь введения вещества должен быть такимже, какой предполагается при использовании наноматериалов в дальнейшем, илитаким, при котором наноматериал воздействует на человека.

При пероральном пути введения предпочтениеотдается введению наноматериала с кормом, однако при этом необходимо убедитьсяв стабильности наноматериалов и отсутствии их изменений в составе корма.Концентрацию наноматериалов в корме необходимо периодически контролировать,чтобы убедиться в равномерности их распределения для уточнения дозы, вводимойкаждому животному.

В случае если ожидается изменениенаноматериалов в составе корма или неравномерное их распределение в корме,изучаемые наноматериалы вводят зондом в желудок.

Изучаемые наноматериалы должны вводитьсяежедневно на протяжении всего периода эксперимента.

В течение всего эксперимента должныиспользоваться образцы наноматериалов одной и той же партии.

6.4.7. Схемы проведениядолгосрочного токсикологического эксперимента при
различных путях введения исследуемого наноматериала.

6.4.7.1.Схема проведения эксперимента при пероральном введении.

Вид животных

Линейные или беспородные белые крысы-самцы (при необходимости дополнительно - крысы-самки)

Продолжительность эксперимента

Не менее 6 месяцев (180 дней)

Возраст

40-50 дней

Карантин

Не менее 10 дней

Исходная масса тела

70-80 г

Рацион

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

Количество животных в группе в начале эксперимента

Ориентировочно с учетом возможной гибели - 36 особей

Описание экспериментальных групп

Группа 1 (контроль) - крысы на протяжении эксперимента находятся на контрольном полусинтетическом рационе и не экспонируются наноматериалами

Группа 2 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно высокую дозу изучаемого наноматериала

Группа 3 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно среднюю дозу изучаемого наноматериала

Группа 4 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно низкую дозу изучаемого наноматериала

Группа 5 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно высокую дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 2)

Группа 6 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно среднюю дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 3)

Группа 7 - крысы получают с кормом или зондом внутрижелудочно низкую дозу вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом (контроль к группе 4)

 

Примечания.

1. Группы 5,6,7 формируются в том случае, если имеются вещества, аналогичные исследуемым наноматериалам, но полученные традиционным способом.

2. Если в составе препарата исследуемого наноматериала присутствует растворитель или носитель, имеющий определенную токсикологическую характеристику, то дополнительно формируются группы животных, которым вводится этот растворитель или носитель в той же дозировке, что и в составе препарата исследуемого наноматериала

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде и содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении в соответствии с установленными требованиями

Содержание животных

Не более чем по 5 крыс в клетке

Забор материалов для исследований

На 30-й и 180-й дни эксперимента

Количество животных в группе, взятых на исследование на забое

Не менее 10 крыс в группе

6.4.7.2. Схема проведения эксперимента приингаляционном введении.

Вид животных

Линейные или беспородные белые крысы-самцы (при необходимости дополнительно - крысы-самки)

 

Экспозиция и продолжительность эксперимента

Ингаляция по 4 ч в день, 5 раз в неделю на протяжении 6 мес. + 6 мес. наблюдения

 

Карантин

Не менее 10 дней

 

Исходная масса тела

36-40 кг

 

Рацион

Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных

 

Количество крыс в группе в начале эксперимента

Ориентировочно с учетом возможной гибели не менее 50

 

Описание экспериментальных групп

Группа 1 (контроль) - крысы находятся в затравочных камерах с ингалированием чистым воздухом

Группа 2 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала высокой дозы

 

Группа 3 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала средней дозы

 

Группа 4 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля наноматериала низкой дозы

 

Группа 5 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, высокой дозы (контроль к группе 2)

 

Группа 6 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, средней дозы (контроль к группе 3)

 

Группа 7 - крысы подвергаются ингаляции аэрозоля вещества, аналогичного по составу изучаемому наноматериалу, но полученного традиционным способом, низкой дозы (контроль к группе 4)

 

Примечание.

Группы 5, 6, 7 формируются в том случае, если имеются вещества, аналогичные исследуемым наноматериалам, но полученные традиционным способом.

 

Условия содержания

Животные получают свободный доступ к корму и воде и содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении в соответствии с установленными требованиями

 

Содержание животных

Не более чем по 5 крыс в клетке

 

Забор материалов для исследований

На 30-й, 180-й дни ингаляции и через 6 мес. наблюдения

 

Количество крыс в группе, взятых на исследование на забое

Не менее 10 крыс в группе

 

Дляоценки реакции легочной ткани наноматериалы вводятся однократноинтратрахеально. Сроки наблюдения 1, 4, 6, 12 мес. Методы контроля: масса сухихи сырых легких, региональных лимфатических узлов, содержание в тканях общихлипидов и оксипролина.

6.4.7.3.Исследуемые показатели.

При выборепоказателей исходят из физико-химических свойств наноматериалов, данныхлитературы о токсичности, опасности, характере биологического действия, наличииструктур и органов мишеней для данного класса соединений.

6.4.7.3.1.Примерный перечень изучаемых показателей, который может изменяться взависимости от имеющейся информации как в сторону расширения, так и в сторонуего сокращения.

Исследуемые показатели

Периодичность сбора данных

1

2

1. Интегральные показатели

 

- общее состояние животных (внешний вид, поведение, двигательная активность, состояние шерстного покрова)

Каждые 2 дня

- поедаемость корма

Ежедневно

- масса тела

1 раз в неделю

- абсолютная и относительная масса внутренних органов (печень, почки, надпочечники, селезенка, сердце, легкие, тимус, гипофиз, головной мозг, семенники, простата и другие при необходимости)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

2. Гематологические показатели

 

- концентрация гемоглобина в крови, гематокрит, общее количество эритроцитов, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула (базофилы, нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты), общее количество тромбоцитов, скорость оседания эритроцитов

На 30-й и 180-й дни эксперимента

3. Биохимические показатели сыворотки крови

 

- общий белок, альбумин, глобулины, глюкоза, креатин, мочевина, общие липиды, холестерин, триглицериды, желчные кислоты, билирубин общий и прямой, минеральный состав (натрий, калий, фосфор, хлориды), аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, альфа-амилаза, липаза, лактатдегидрогеназа, холинэстераза

На 30-й и 180-й дни эксперимента

4. Общий анализ мочи

 

- суточный диурез, цвет и прозрачность, относительная плотность, рН, белок, глюкоза, креатинин

На 30-й и 180-й дни эксперимента

5. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- активность ферментов 1 и 2 фазы метаболизма ксенобиотиков (общее содержание цитохромов Р-450 и b5, N-деметилирование амидопирина, О-деметилирование р-нитроанизола, гидроксилирование 3,4-бенз(а)пирена, О-деэтилирование 7-этоксикумарина, О-деэтилирование 7-этоксирезоруфина, О-деэтилирование 7-пентоксирезоруфина, эпоксидгидролаза, UDP-глюкуронозилтрансфераза, глутатионтрансфераза)

 

6. Стабильность мембран лизосом клеток печени

 

- общая и неседиментируемая активность (β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, арилсульфатазы А и В

На 30-й и 180-й дни эксперимента

7. Система регуляции апоптоза

 

- активность каспазы 3 в гомогенатах ткани печени и головного мозга

На 30-й и 180-й дни эксперимента

8. Система антиоксидантной защиты

 

- активность ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах (глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени (малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- продукция активных форм кислорода и их метаболитов (концентрация нитратов и нитритов в плазме крови и печени)

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- концентрация антиоксидантов: восстановленный глутатион печени, общая антиоксидантная активность плазмы крови

На 30-й и 180-й дни эксперимента

9. Воспалительная реакция

 

- измерение концентрации маркеров воспаления (фактора некроза опухоли альфа, фактора роста опухоли бета-1, интерлейкина 1-бета) в сыворотке крови

На 30-й и 180-й дни эксперимента

10. Морфологические исследования

 

- макроскопические, микроскопические исследования, морфометрический анализ (легкие, сердце, аорта, желудок, тонкая и толстая кишка, печень, поджелудочная железа, почки, семенники, простата, селезенка, лимфатические узлы, тимус, щитовидная железа, надпочечники, гипофиз, головной мозг, кожа

На 30-й и 180-й дни эксперимента

- макроскопические, микроскопические исследования внутренних органов в случае гибели животных в течение эксперимента для установления причины смерти

В течение эксперимента

- дополнительные исследования: гистохимические исследования, иммуногистохимические исследования клеточных популяции, электронно-микроскопические исследования

На 30-й и 180-й дни эксперимента

11. Изучение распределения

 

- изучение распределения наночастиц в различных органах (легкие, сердце, желудок, тонкая и толстая кишка, печень, поджелудочная железа, почки, семенники, простата, селезенка, лимфатические узлы, тимус, щитовидная железа, надпочечники, головной мозг) соответствующими методами при их наличии

На 30-й и 180-й дни эксперимента

12. Исследование бронхоальвеолярного лаважа при ингаляционном пути введения

 

- активность лактатдегидрогеназы, j-глутамил-транспептидазы, щелочной фосфатазы, содержание общего белка лаважной жидкости

На 30-й и 180-й дни эксперимента

7. Проведение исследований по изучению
отдаленных эффектов действия наноматериалов

7.1. Изучение мутагенных свойствнаноматериалов.

7.1.1. Изучение мутагенныхсвойств наноматериалов проводят в тесте учета аберраций хромосом в клеткахкостного мозга, тесте учета микроядер в клетках, тесте учета доминантныхлетальных мутаций в зародышевых клетках мышей и тесте выявления поврежденийДНК.

7.1.2. Метод учета аберрацийхромосом в клетках костного мозга (основан на регистрации видимых структурныхнарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы).

7.1.2.1. Лабораторные животные- мыши линии С57В1/6 с исходной массой тела 18-20 г. Количество животных вгруппе - не менее 10 особей. Карантин - 10 дней.

7.1.2.2. Животные находятся наполусинтетическом рационе, указанном в пункте5.8 настоящих методических указаний.

7.1.2.3. Испытуемыенаноматериалы вводятся ежедневно на протяжении 4-5 сут. Фиксацию клеточногоматериала осуществляют через 6 и 24 ч после последнего введения. Контрольнуюгруппу составляют мыши, которым не вводили испытуемых наноматериалов.

В случаенеобходимости, когда отсутствуют данные по аналогичным материалам, полученнымтрадиционными методами, и растворителям или носителям наноматериалов, отдельноформируют группы животных для проведения исследований на этих наноматериалах.

7.1.2.4. Анализируют 100метафаз от каждого животного; при этом учитывается число одиночных и парныхфрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов)и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клетокс полной деструкцией хромосом.

7.1.2.5. Оценкурезультатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клетокс хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах.

7.1.3. Метод учета микроядер вклетках (основан на регистрации клеток с микроядрами).

7.1.3.1. Лабораторные животные- мыши линии С57В1/6 с исходной массой тела 18-20 г. Количество животных вгруппе - не менее 10 особей. Карантин - 10 дней.

7.1.3.2. Животные находятся наполусинтетическом рационе, указанном в пункте5.8 настоящих методических указаний.

7.1.3.3. Испытуемыенаноматериалы вводятся ежедневно на протяжении 4-5 сут. Фиксацию клеточного материала осуществляют через 6 и 24ч после последнего введения. Контрольную группу составляют мыши, которым невводили испытуемых наноматериалов.

В случаенеобходимости, когда отсутствуют данные по аналогичным материалам, полученнымтрадиционными методами, и растворителям или носителям наноматериалов, отдельноформируют группы животных для проведения исследований на этих наноматериалах.

7.1.3.4. Анализируют 2 000полихроматофильных эритроцитов костного мозга от каждого животного, соотношениенормо- и полихроматофильных эритроцитов определяют при подсчете 500эритроцитов.

7.1.3.5. При оценкерезультатов следует ориентироваться на статистически достоверное, по сравнениюс контролем, увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами.

7.1.4. Метод учета доминантныхлетальных мутаций в зародышевых клетках мышей (основан на учетепостимплантационной смертности).

7.1.4.1. Лабораторные животные- мыши линии С57В1/6 с исходной массой тела 18-20 г. Количество животных в группе- не менее 10 особей. Карантин - 10 дней.

7.1.4.2. Животные находятся наполусинтетическом рационе, указанном в пункте 5.8 настоящих методическихуказаний.

7.1.4.3. Для выявлениявозможного отрицательного эффекта исследования проводятся в течение 3 нед. Накаждую исследованную дозу берут не менее 15 самцов. После введения исследуемогонаноматериала или контрольного вещества к каждому самцу подсаживают по 3виргинные самки. Подсадка самок к подопытным самцам производится еженедельно напротяжении 3 нед., что дает возможность оценить действие наноматериалов наполовые клетки в постмейотическом периоде - зрелые сперматозоиды, поздние иранние сперматиды. Отсаженных беременных самок вскрывают на 15-17 деньбеременности и подсчитывают число желтых тел, количество живых и мертвыхэмбрионов. По этим данным рассчитывают постимплантационную смертность.

7.1.4.4. В случаенеобходимости, когда отсутствуют данные по аналогичным материалам, полученнымтрадиционными методами, и растворителям или носителям наноматериалов, отдельноформируют группы животных для проведения исследований на этих веществах.

7.1.5. Тест на выявлениеповреждений ДНК, предусматривающий оценку целостности структуры ДНК методомщелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет), проводитсяв соответствии с методическими рекомендациями «Применение метода щелочногогель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойствприродных и синтетических соединений» (утверждены РАМН и РАСХН, Москва, 2006).

7.2. Изучение репродуктивной токсичностинаноматериалов.

7.2.1. Изучение репродуктивнойтоксичности наноматериалов проводится в эксперименте на лабораторных животных ивключает исследования генеративной функции, эмбриотоксического и тератогенногодействия в пренатальном и постнатальном периоде развития, а также принеобходимости изучение плодовитости и общей репродуктивной функции.

7.2.2. Исследования проводятсяна крысах линии Вистар с исходной массой тела 100-120 г. Карантин - 10 дней.Животные находятся на полусинтетическом рационе, указанном в пункте 5.8настоящих методических указаний.

7.2.3. Количество животных вгруппе - не менее 50 особей (из них 30 самок и 20 самцов).

Распределение погруппам: 1 группа - контрольная группа крыс (самцы и самки) получает напротяжении всего эксперимента полусинтетический рацион; 2 группа (самцы исамки) получает полусинтетический рацион с включением аналога наноматериала,полученного традиционным способом (если таковой имеется); 3 группа крыс (самцыи самки) получает полусинтетический рацион с включением исследуемогонаноматериала в том же количестве, что и крысы 2 группы. Животные находятся наэтих рационах не менее 30 дней до спаривания, во время спаривания,беременности, лактации. Полученное потомство находится на этих рационах до моментаполовой зрелости.

7.2.4. В период всегоэксперимента регистрируется общее состояние животных (внешний вид, двигательнаяактивность, состояние шерсти), поедаемость корма (ежедневно), масса тела (1 разв нед.).

7.2.5. Показатели,характеризующие генеративную функцию:

• половозрелые самцы -морфологические исследования семенников (индекс сперматогенеза, среднееколичество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количествоканальцев с 12-й стадией мейоза);

• половозрелые самки: морфологическиеисследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и болееслоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтыетела, общее количество генеративных форм).

7.2.6. Эмбриотоксическое итератогенное действие наноматериалов в пренатальном периоде.

Для спаривания вклетку к двум самкам подсаживают вечером одного самца, утром осуществляютмикроскопирование влагалищных мазков. Первый день беременности определяют поналичию сперматозоидов во влагалищных мазках. По 10 беременных самок из каждойгруппы забивают на 19-20 день беременности. Плоды извлекают из рогов матки иобследуют визуально для обнаружения видимых аномалий развития, после этогоплоды взвешивают. После наружного осмотра плоды каждого помета делят на 2 группы.Одну группу используют для изучения внутренних органов, а вторую группуиспользуют для изучения состояния скелета. Подсчитывают количество желтых тел,количество мест имплантаций, количество резорбций, количество живых и мертвыхплодов с расчетом пред- и постимплантационной эмбриональной смертности,краниокаудальный размер, количество обследованных плодов (из них с аномалиямиразвития).

7.2.7. Эмбриотоксическое итератогенное действие наноматериалов в постнатальном периоде.

По 15 беременных самок в каждой группеоставляют до родов и проводят изучение потомства: количество живых и мертвыхкрысят, подсчет особей разного пола, их внешний вид, установление внешнихуродств, измерение массы тела и краниокаудального размера. Потомство взвешиваютпри рождении, затем еженедельно. Учитывают следующие показателифизиологического развития крысят: сроки отлипания ушных раковин, появлениепервичного волосяного покрова, открытие глаз, прорезывание резцов, опусканиесеменников, открытие влагалища, выживаемость потомства. Наблюдения запотомством осуществляют ежедневно в течение 30 дней и рассчитывают выживаемостьна 30-й день.

7.2.8. Изучение плодовитости иобщей репродуктивной функции в эксперименте на двух поколениях животных (принеобходимости).

7.2.8.1. Исходное количествоживотных в группе должно составлять 10 самцов и 20 самок. F0родительское поколение получает исследуемый наноматериал в течениеэкспозиционного периода (70 дней), периода беременности и до окончаниявскармливания F1 поколения. После достижения животными F1 зрелости(≈ 3 мес.) их спаривают и получают потомство F2. Как вопытной, так и в контрольной группах F1 и F2 должно быть получено потомство не менее, чем от 10самок. При изучении физического развития потомства F1 и F2регистрируют размер помета, число живых и мертворожденных плодов, число особейразного пола, динамику массы и выживаемость молодняка на 4-й, 7-й, 14-й, 21-й и30-й дни после рождения, а также сроки отлипания ушной раковины, появлениепервичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, переход ксамостоятельному питанию, опускание семенников, открытие влагалища.

7.2.8.2. В возрасте 30 дней употомства изучают эмоционально-двигательное поведение с использованием теста«открытое поле», определяют суммационно-пороговый показатель, статическуюработоспособность.

7.2.8.3. За единицу наблюденияпринимают помет. Полученные данные обрабатывают статистически, сравнивают сконтролем и регистрируют в таблицах.

7.2.9. Отчет по результатамисследований репродуктивной токсичности наноматериалов должен включать цифровыеданные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения оналичии или отсутствии у исследуемого наноматериала неблагоприятного действияна внутриутробное развитие и процессы репродукции.

8. Иммунологические исследования и оценка
потенциальной аллергенности наноматериалов

8.1. Иммунологическиеисследования наноматериалов проводят в эксперименте на мышах линий СВА иС57В1/6 и включают исследование иммуномодулирующего действия наноматериалов нагуморальное звено иммунитета, изучение иммуномодулирующего действиянаноматериалов на клеточное звено иммунитета, изучение наноматериалов в тестечувствительности мышей к гистамину и изучение влияния наноматериалов наестественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллам мышиного тифа).

8.2. Введение наноматериаловлабораторным животным осуществляют путем, который предполагается прииспользовании наноматериалов в дальнейшем.

Изучаемые наноматериалы должны вводиться ежедневнона протяжении всего периода эксперимента. Время введения составляет 21 день.Количество наноматериала рассчитывают на единицу массы тела животного по даннымежедневного взвешивания.

В течение всего эксперимента должныиспользоваться образцы наноматериалов одной и той же партии.

8.3. Для изучения возможных иммунотоксическихсвойств наноматериалов используют мышей линий СВА и С57В1/6 с исходной массойтела 18-20 г, прошедших карантин в течение 10 дней. Все экспериментальныеживотные находятся на полноценном полусинтетическом рационе (п.5.8).

8.4. Изучаются 2-3 дозыисследуемого наноматериала.

8.5. В течение всегоэксперимента фиксируются общее состояние животных, характер двигательнойактивности, состояние волосяного и кожного покрова, потребление корма и воды,изменения массы тела.

В случае гибели животных во времяпроведения эксперимента у всех погибших животных проводятся макроскопическое имикроскопическое исследование внутренних органов с целью установления причингибели.

8.6. Распределение по группам.Животных каждой линии разделяют на следующие группы: 1 группа - контрольная(животные находятся на полусинтетическом рационе); 2-4 группы находятся наполусинтетическом рационе и получают изучаемые наноматериалы в различныхконцентрациях; животные 5-7 групп находятся на полусинтетическом рационе иполучают вещество, аналогичное по составу изучаемому наноматериалу, нополученное традиционным способом (если такое имеется).

Если в составе препарата исследуемогонаноматериала присутствует растворитель или носитель, имеющий определенную токсикологическуюхарактеристику, то дополнительно формируются группы животных, которым вводитсяэтот растворитель или носитель в той же дозировке, что и в составе препаратаисследуемого наноматериала.

8.7. Исследованиеиммуномодулирующего действия наноматериалов на гуморальное звено иммунитета.

В каждой группе должно быть не менее 20особей. Изучаемый наноматериал вводится мышам в течение 21 дня, после чегоживотным опытных и контрольных групп вводится внутрибрюшинно 0,5 мл дисперсииэритроцитов барана (концентрация 20 млн. клеток/мл). Забор крови проводится на7-й, 14-й и 21-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку кровититруют в реакции гемагглютинации общепринятым методом. Подсчитывают среднееарифметическое титров гемагглютининов в каждой группе мышей.

8.8. Изучениеиммуномодулирующего действия наноматериалов на клеточное звено иммунитета.

В каждой группе должно быть не менее 15особей. Изучаемый наноматериал вводится мышам обеих линий в течение 21 дня,после чего животным опытных и контрольных групп подкожно в межлопаточнуюобласть вводят эритроциты барана в дозе 1 млн. клеток на мышь в объеме 0,1 мл.На пятый день всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозуэритроцитов барана в концентрации 109 клеток на мышь в объеме 0,02мл. В контрлатеральную подушечку лапы в том же объеме -0,95 %-й раствор натрияхлорида. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18-20 ч путемопределения веса опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакцииопределяют по индексу реакции.

8.9. Изучение наноматериалов втесте чувствительности мышей к гистамину.

В каждой группе должно быть не менее 15особей. Изучаемый наноматериал вводится мышам линии С57В1/6 в течение 21 дня,после чего животным опытных и контрольных групп внутрибрюшинно вводят растворгистамина гидрохлорида в дозе 2,5 мг на мышь в объеме 0,5 мл физиологическогораствора. Реакцию учитывают через 24 ч по проценту гибели мышей.

8.10. Изучение влияниянаноматериалов на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонелламмышиного тифа).

Изучение влияния продукта на естественнуюрезистентность мышей к сальмонеллам мышиного тифа проводят на моделивнутрибрюшинного заражения мышей линии C57BL1/6десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм415. В каждой группе должно быть не менее 30 мышей. Изучаемый наноматериалвводится в течение 21 дня, после чего животных опытных и контрольных группзаражают тремя дозами культуры: 1000; 100 и 10 микробных клеток на мышь.Наблюдение за животными производится в течение 14 дней. Рассчитывают LD50 вопытной и контрольной группе, процент гибели животных по каждой дозе и проводятсравнительный анализ результатов.

8.11. Оценку потенциальной аллергенностинаноматериалов проводят в эксперименте на лабораторных животных. Потенциальнуюаллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии иуровня циркулирующих сенсибилизирующих антител субклассов lgG1 + lgG4 у крысконтрольных и опытных групп.

Метод основан на количественнойоценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшиннойсенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном - овальбумином куриного яйца споследующим внутривенным введением сенсибилизированным животным разрешающейдозы того же белка.

8.11.1. Исследованияпроводятся на крысах линии Вистар с исходной массой тела 150-180 г. Карантин втечение 10 дней. Все животные находятся на полусинтетическом рационе, указанномв п.5.8 настоящих методических указаний. Всоставе корма не должно содержаться яичного белка!

8.11.2. Путь введения наноматериаладолжен быть таким же, как и предполагаемый путь его воздействия на человека.Изучаемые наноматериалы должны вводиться ежедневно на протяжении всего периодаэксперимента. В течение всего эксперимента должны использоваться образцынаноматериалов одной и той же партии.

8.11.3. Количествоживотных в группе - не менее 25 особей. Формируют 3 группы экспериментальныхживотных: 1 группа - контрольная, получающая полусинтетический рацион; 2 группа- животные находятся на полусинтетическом рационе и подвергаются воздействиюизучаемого наноматериала; 3 группа - животные находятся на полусинтетическомрационе и подвергаются воздействию аналога исследуемого наноматериала (еслитаковой имеется), полученного в традиционной форме.

8.11.4 Продолжительностьэксперимента - 29 дней.

8.11.5. На 1-й, 3-й и 5-йдень эксперимента крыс внутрибрюшинно сенсибилизируют овальбумином куриногояйца в дозе 100 мкг вместе с дисперсией гидроксида алюминия, вводимой в дозе,эквивалентной 0,5 мг алюмокалиевых квасцов, а на 21-й день эксперимента вводятв тех же условиях дополнительную («бустерную») дозу антигена, уменьшенную в 10раз по сравнению с первоначальной дозой. Кормление рационами и введениенаноматериала и его аналога продолжают до утра 29 дня эксперимента, после чеговнутривенно вводят раствор овальбумина куриного яйца в дозе 5-30 мг/кг массытела (вводимая доза должна обеспечивать летальность животных контрольной группыв пределах 30-50 %) и на протяжении 24 ч оценивают тяжесть реакции анафилаксиипо следующим показателям: вялость, озноб, одышка, атаксия, цианоз, парез заднихконечностей, судороги, паралич, летальный исход и рассчитывают анафилактическийиндекс как среднее арифметическое балльных оценок тяжести реакций по группе.

8.11.6.Тяжесть реакции оценивают в соответствии со шкалой:

Проявления

Тяжесть реакции (балл)

Нет реакции

0

Вялость, кожный зуд, озноб, одышка

1

Атаксия, цианоз кожных покровов, парез задних конечностей

2

Судороги, паралич

3

Летальный исход

4

8.11.7. Непосредственно перед введениемразрешающей дозы у крыс из хвостовой вены отбирают 0,2-0,3 мл крови дляопределения уровня специфических антител. Концентрацию или титр антителопределяют методом непрямого твердофазного иммуноферментного теста наполистирольных планшетах.

8.11.8.Достоверность различий тяжести анафилаксии определяют в соответствии с U-тестомуглового преображения Фишера для долевых показателей. Достоверность различийдополнительно проверяют с помощью непараметрического рангового теста Мана-Уитнии многомерного непараметрического критерия хи-квадрат.

8.11.9.Достоверность различий средних значений и дисперсий концентраций или титров антителк овальбумину куриного яйца определяют с использованием критерия Стьюдента и F-тестана остаточную дисперсию Фишера. Дополнительно проверяют достоверность различийраспределения в сравниваемых группах с использованием непараметрическогорангового критерия Мана-Уитни.

498
Мне нравится
Комментировать Добавить в закладки

Комментарии могут оставлять только зарегистрированные пользователи.

Пожалуйста зарегистрируйтесь или авторизуйтесь на сайте.