МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Микробиологические методы определения наличияантибиотиков

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным закономот 27 декабря 2002г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальныхстандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Россельхозакадемии (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии) и Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭРоссельхозакадемии)

2ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническомурегулированию и метрологии от 26 февраля 2010 г. № 25-ст

4ВЗАМЕН ГОСТ Р 51600-2000

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемоминформационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будетопубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационнойсистеме общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническомурегулированию и метрологии в сети Интернет

Содержание

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Дата введения - 2011-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое коровье молоко (далее - молоко) и устанавливает качественныемикробиологические методы определения наличия антибиотиков:

- чашечный метод с Bacillus stearothermophilus,

- метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур,

-метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологическогоанализа

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиеническиетребования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2493-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Техническиеусловия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9285-78 Калия гидрат окиси технический. Технические условия

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Техническиеусловия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общиетехнические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 19881-74 Анализаторы потенциометрические для контроля рН молока и молочных продуктов. Общие технические условия

ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ

ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды

ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака

ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Еслиссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Оборудование, средства измерений, посуда, материалы и реактивы

3.1Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешностиоднократного взвешивания ± 0,0002г.

3.2Холодильник бытовой по ГОСТ 16317, поддерживающий температуру от 0 °С до 12 °С.

3.3 Центрифуга с частотой вращения 3000 мин^-1 и разделяющим фактором 750 м/с².

3.4Пробирки центрифужные термостойкие вместимостью 25 см³ по ГОСТ 1770 .

3.5 Термостат или блок термостатированных ячеек, поддерживающий температуру от 30 °С до 70 °С с допустимой погрешностью ± 0,5 °С.

3.6 Баня водяная с терморегулятором, поддерживающая температуру от 60 °С до 90 °С.

3.7 Анализатор потенциометрический по ГОСТ 19881 2-го класса точности с диапазоном измерения от 5,5 до 8,0 единиц рН.

3.8Сепаратор-сливкоотделитель.

3.9Шкаф сушильный, поддерживающий температуру (160 ± 5) °С.

3.10Автоклав, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.11 Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, поддерживающий температуру (121 ± 2) °С.

3.12Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

3.13Микроскоп световой биологический.

3.14Пробойник диаметром 10мм или сверло пробочное № 4.

3.15Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.

3.16Линейка по ГОСТ 427 с пределом измерения 150 мм.

3.17Аппарат «Микрофот 5ПО-1» или другой проекционный аппарат.

3.18Колбы конические по ГОСТ 25336, вместимостью 25, 100, 250 см³.

3.19Колбы мерные по ГОСТ 1770 , вместимостью 200 и 1000 см³.

3.20Пробирки по ГОСТ 1770 , вместимостью 10 см³.

3.21Чашка Петри по ГОСТ 25336.

3.22Пипетки градуированные 2-го класса точности по ГОСТ 29227, вместимостью 5,10 и 25 см³.

3.23 Пипетки, отмеряющие объем 0,05 и 0,1 см³.

3.24 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 0,1 см³ или шприц-дозатор автоматическийвместимостью 1,0 см³, настроенный на объем пробы 0,1 см³.

3.25Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см³.

3.26Пинцет.

3.27Гидролизат кормовых дрожжей.

3.28Эталон стандартный мутности по [1].

3.29Препарат сухой для контроля определения ингибирующих веществ в молоке (СКИВ) по [2].

3.30Образец стандартный стрептомицина по [3].

3.31 Фуксин основной по [4],спиртовой раствор концентрации 0,05 г/см³.

3.32 Экстракт дрожжевой по [5].

3.33Глюкоза по ГОСТ 975.

3.34Пептон сухой ферментированный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

3.35Агар микробиологический по ГОСТ 17206.

3.36Натрий хлористый по ГОСТ 4233 .

3.37Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198.

3.38Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

3.39 Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285, раствор с массовой концентрацией 0,056 г/см³.

3.40 Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой концентрацией 0,0365 г/см³.

3.41Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 .

3.42 Тест-культура № 1 (тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510)¹⁾- тест-культура Bacillus stearothermophilus.

3.43 Среда № 1 (среда агаровая питательная таблетированная «Delvotest^® SP»)²⁾- питательком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем.

3.44 Среда № 2 (агаровая среда «Delvotest^® SP»)³⁾- агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см³, собранные в блоки.

3.45 Среда № 3 (среда «Delvotest^® SP-NT» или «Delvotest^® SP MINI-NT»)⁴⁾ - смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бром-крезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см³, собранные в блоки.

3.46 Тест-набор № 1 (тест-набор «BRT Inhibitor Test»)⁵⁾, включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.

Применение конкретных видов оборудования, средств измерений, материалов и реактивов осуществляется в соответствии с требованиями разделов 4и 5.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

¹⁾ Тест-культура Bacillus stearothermophilus BKMB-510, выпускаемая Институтом биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

²⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована питательная среда «Delvotest® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

³⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована агаровая среда «Delvotesl® SP» (OOO «ДСМ Восточная Европа»).

⁴⁾ Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендованы среды «Delvotest^® SP-NT» и «Delvotest^® SP MINI-NT» (OOO «ДСМ Восточная Европа»)

⁵⁾ Тест-набор является рекомендуемым к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанного тест-набора. Допускаются к использованию тест-наборы производства других изготовителей, предназначенныедляцелей описываемых методов. Рекомендован тест-набор «BRT Inhibitor Test» (OOO «Xp. Хансен»).

4 Отбор и подготовка проб

Отбор проб и подготовка проб - по ГОСТ Р 53430 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 24 ч.

5 Методы контроля

5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus

Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметразоны ингибиции.

5.1.1 Подготовка к определению

5.1.1.1Подготовка лабораторной посуды - по ГОСТ Р 51446.

5.1.1.2 Приготовление сред

Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой дометки и потенциометрическим анализатором по 3.7устанавливают активность питательной среды(7,1 ± 0,1) единиц рН. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью250 см³ наливают по 200 см³ приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторепо 3.11при температуре (121 ±2) °С в течение (15 ± 1) мин.

Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см³ вносят 100 см³ дистиллированной воды, 1,0 ггидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагреваютна электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55 ± 5) °С, устанавливают активность агаровой среды (7,3 ±0,1) единиц рН и стерилизуют при температуре (121 ±2) °С втечение (15 ± 1) мин.

Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - 1 мес.

Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.

5.1.1.3 Получение спор тест-культуры

Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2 -3 см³ тест-культуры № 1 по 3.42,выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18 -20 ч, тщательно перемешивают, помещают втермостат и нагревают при температуре (55 ± 1) °С в течение 3 сут.

После окончания инкубации из посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31с массовой концентрацией 50 г/дм³ и микроскопируют. При наличии в колбах спосевами 90 % - 95 % свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16 - 18 чдля осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадокраспределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3и центрифугируют 20 -30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (неменее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.

Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин и переносят впробирки.

Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 2 мес.

5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды

В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3,и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности по [1].

К 100 см³ расплавленной и охлажденной до (60 ±2)°С агаровой среды, подготовленнойпо 5.1.1.2, добавляют 2,5 см³ 40 %-ного водного раствора глюкозы и 4 см³ суспензии спор, подготовленной как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11 ±1) см³ в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности.

Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петрипрогревают в термостате при температуре (55 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока

а) Подготовка проб

Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066, ГОСТ 24067. В стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5 -10 см³ анализируемой пробы молока, нагревают наводяной бане при температуре (87 ± 2) °С в течение (10 ± 1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °С- 25 °С.

б) Приготовление обезжиренного стерильного молока

Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454, с кислотностью 16 -18 °Т при помощи сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см³ и стерилизуют при 101 кПа (1 атм.) в течение (10 ± 1) мин.

5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина

Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.

а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2

Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (6,1 ± 0,1)с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39или соляной кислотыпо 3.40.

Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см³ в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (7,9 ± 0,1) с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.

Растворы стерилизуют при температуре (112 ± 2) °С в течение (30 ± 1) мин.

Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

б) Приготовление основного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 500 мкг/см³

(5 ± 1) мг стрептомицина по [3] растворяют в конической колбе вместимостью 25 см³ в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина кобъему буферного раствора 1 должно быть 1:100.

Пример - При массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см³ 5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см³ буферного раствора 1, получив основной раствор с массовой концентрацией 500 мкг/см³.

Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5 ± 1) °С - не более 30 сут.

в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина с массовой концентрацией 2,5 мкг/см³ Подготавливают три стерильных пробирки вместимостью 10 см³. В первую пробирку наливают

1 см³ фосфатного буферного раствора 2 и 1 см³ основного раствора стрептомицина, во вторую - 9 см³ фосфатного буферного раствора 2 и 1 см³ раствора из первой пробирки, в третью - 9 см³ стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5 б) и 1 см³ раствора из второй пробирки.

Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет соответственно 250; 25 и2,5 мкг/см³. Третье разведение с массовой концентрацией 2,5 мкг/см³ является контрольным раствором.

Срок хранения контрольного раствора стрептомицина - не более 12 ч.

Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по [2].

5.1.2 Проведение определения

5.1.2.1На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петрипо 5.1.1.4, пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семьлунок диаметром 10мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм ихцентров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.

5.1.2.2В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой по 3.23вносят по 0,05 см³ анализируемого молока, подготовленногопо 5.1.1.5а). В центральную лунку вносят 0,05 см³ контрольного раствора стрептомицина.

Рисунок 1 -Схема расположения лунок

5.1.2.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре втечение 20 мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55 ± 1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.

5.1.3 Обработка результатов

5.1.3.1 Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.

Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотикамив пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или нааппарате «Микрофот 5ПО-1» по краям окружностей зон.

5.1.3.2При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.

5.1.3.3Зона ингибиции диаметром 12мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков ванализируемой пробе молока.

Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.

(Поправка.ИУС 12-2010 г.)

5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis C953 от фиолетовой до желтой - при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски - при наличии антибиотиков.

5.2.1 Подготовка к определению

5.2.1.1 Подготовка бутылочек со средой № 1

Стеклянную бутылочку со средой № 1 по 3.43вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре (20 ± 5) °С.

Открывают бутылочку, колпачок помещают на стол вниз донышком.

Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачокнеобходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.

5.2.1.2 Подготовка ампул со средами № 2 и № 3

Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают необходимое число ампул от блока со средой № 2 по 3.44или средой № 3 по 3.45и маркируют их. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильникепри температуре (5 ± 1) °С.

Соединительной частью шприца-дозатора по 3.24прокалывают укупорочный материал ампул сосредами № 2 или № 3. В каждую открытую ампулу со средой № 2 пинцетом помещают по одной таблетке среды № 1 по 5.2.1.1.Затем бутылочку с таблетированной питательной средой по 5.2.1.1плотнозакрывают колпачком и хранят при температуре (20 ± 2) °С.

5.2.2 Проведение определения

5.2.2.1 В каждую ампулу по 5.2.1.2 шприцем-дозатором вносят 0,1 см³ анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильникепри температуре (5 ± 1) °С до окончания определения.

Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0 ± 0,5) °С в течение 3 ч.

5.2.2.2 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1. В ампулу вносят 0,1 см³ предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.

5.2.3 Обработка результатов

5.2.3.1Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого анализируемого молока.

5.2.3.2Желтый цвет содержимого ампул с анализируемыми пробами молока свидетельствует оботсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимогоампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.

5.2.3.3Фиолетовый цвет содержимого ампул с контрольной пробой и анализируемыми пробамимолока свидетельствует о наличии антибиотиков.

5.3 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный

Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis от синей до желтой при отсутствии в испытуемом молоке антибиотиков и другихингибирующих веществ и сохранении синей окраски - при наличии антибиотиков.

5.3.1 Подготовка к определению

Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора № 1 по 3.46 или беруттребуемое количество пластин или пробирок тест-набора № 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовыхполосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5 ± 1) °С.

5.3.2 Проведение определения

5.3.2.1При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоскиодноразовой пипеткой вносят 0,1 см³ контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46,в другую ячейку - 0,1 см³ контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластиныили полоски вносят по 0,1 см³ анализируемого молока в двукратной повторности.